专利名称：一种内参内置型双荧光素酶报告载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与细胞生物学领域，涉及一种用于微小RNA(microRNA)靶 分子鉴定和活性分析的报告载体。
背景技术：
微小RNA (microRNA)是一类长约19 25nt、能在转录后水平负调节靶mRNA表 达的小分子单链非编码 RNA (CHIANG，H. R. ；SCHOENFELD, L. W. ；RUBY, J. G. ；AUYEUNG, V. C.； SPIES, N. ；BAEK, D. JOHNSTON, W. K. ；RUSS, C. ；LU0, S. ；BABIARZ, J. E. ；BLELLOCH, R.； SCHROTH, G.P. ；NUSBAUM, C.andBARTEL, D.P. (2010). Mammalian microRNAs experimental evaluation of noveland previously annotated genes.Genes Dev, vol. no. p.doi gad. 1884710 [pii] 10. 1101/gad. 1884710.)。它们广泛存在于真核生物体内，参与生物体发 育过程中细胞分化、增殖、凋亡等多种生理病理途径的调控(S0NG，G. ；ZHANG, Y. andffANG, L. (2009) · MICR0RNA-206 targets N0TCH3, activates apoptosis, inhibitstumor cell migration and foci formation. J Biol Chem,vol. no. p. doi :M109. 046862[pii]10. 1074/ jbc. M109. 046862.)。目前普遍认为，miRNA及其靶mRNA结合的特异性主要由“种子序列 (seed sequence) ” (guide strand 的第 2 至第 8 个核苷酸)调控(BRENNECKE, J. ；STARK, Α. ；RUSSELL,R. B. and COHEN,S. Μ. (2005). Principles ofmicroRNA-target recognition. PLoS Biol, vol. 3，no. 3，p. e85. doi :10. 1371/journal. pbio. 0030085.)。已有证据表明， miRNA识别靶标mRNA序列的特异性并不是很高。在动物体内，微小RNA与靶分子序列不需要 完全互补即可发挥作用，有研究者指出，有一些miRNA的靶mRNA可以多达数百种(BACKES， C. ；MEESE,E. ；LENH0F,H. P. and KELLER,Α. (2010). A dictionary on microRNAsand their putative target pathways. Nucleic Acids Res, vol. 38, no. 13, p.4476—4486. doi gkql67[pii] 10. 1093/nar/gkql67.)。因此如何快速准确的筛选和鉴定微小RNA的靶分子 是目前微小RNA研究领域的最大瓶颈。目前已有多个报告系统用于实现上述目的，其中最 常用的是双荧光素酶报告基因系统(BARTEL，D. P. (2009). MicroRNAs target recognition and regulatory functions. Cell, vol. 136，no. 2，p. 215—233. doi :S0092_8674(09)00008 -7[pii] 10. 1016/j. cell. 2009. 01. 002.)。现有的双荧光素酶报告系统包括两个单独的载 体，一个含有海肾荧光素酶基因(彻1^11￡1111(^作1^紹，1 111(3)，在其3’^1 含有多克隆位点， 用于克隆预测靶基因的目的片段；另一个含有萤火虫荧光素酶基因(Firefly luciferase, Flue)，用作转染和数据标准化的内参。因此，这个报告系统需要制备，转染两个载体，其缺 点显而易见(1)步骤较为复杂，无形中增加了物质成本和劳动量；( 重复性差，批次内差 异和批次间差异较大，结果不稳定，易造成误判。针对上述缺陷，我们设计了内参内置型荧 光素酶报告载体，利用一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法，将 萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因置于同一个载体上，同时在海肾荧光素酶基因的 3’非翻译区引入多克隆位点以方便目的片段的克隆。相比现有技术，本发明具有重复性高， 复孔变异小，操作简便，定量准确的优点。本发明的内置型双荧光素酶报告载体适用于微小RNA靶分子的筛选，鉴定和确认，也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化.
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种内参内置型双荧光素酶报告载体，使其 不仅可以用于微小RNA靶分子的筛选，鉴定和确认，同时也可以作为生物感应器，测量体内 微小RNA的生物学活性。本发明首先提供一种内参内置型双荧光素酶报告载体，萤火虫荧光素酶基因融合 到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因和氨苄青霉素抗性基因之间，两种荧光素酶处于同一 个载体上，萤火虫荧光素酶基因作为内参，序列为SEQ ID No:4所示。本发明还提供上述内参内置型双荧光素酶报告载体的构建方法。该方法包括以下 步骤(1)根据萤火虫荧光素酶基因和报告载体pRL-TK的序列，设计、合成嵌合体引物 pF-Fluc, pR-Fluc 和 PiR ；其中，pF-Fluc 为5，AAGGATCCAGGTGGCACTTTTCG TGCGATCTGCATCTCAATTAG3',pR-Fluc 为
权利要求
1.一种内参内置型双荧光素酶报告载体，其特征在于，萤火虫荧光素酶基因融合到 pRL-ΤΚ载体的海肾荧光素酶基因和氨苄青霉素抗性基因之间，两种荧光素酶处于同一个载 体上，萤火虫荧光素酶基因作为内参，序列为SEQ ID No:4所示。
2.权利要求1所述内参内置型双荧光素酶报告载体的构建方法，其特征在于，包括以 下步骤(1)根据萤火虫荧光素酶基因和报告载体PRL-TK的序列，设计、合成嵌合体引物 pF-Fluc, pR-Fluc 和 PlR ；其中，pF-Fluc 为5’ AAGGATCCAGGTGGCACTTTTCGTGCGATCTGCATCTCAATTAG3’， pR-Fluc 为5’ GAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACCTCACATGTTCTTTCCTGC3’ PlR 为 5’ CGAAAAGTGCCACCTGGATCCTT3‘；(2)实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR方法，获得萤火虫荧光素酶基因和报告载体 pRL-ΤΚ的融合线性片段；(3)Dpn /消化PCR产物，去除带甲基化的模板质粒DNA ；(4)转化大肠杆菌菌株DH5α ；(5)挑取单克隆菌落测序鉴定；(6)酶切确认重组质粒的整合情况。
3.权利要求1所述的内参内置型双荧光素酶报告载体，用于微小RNA靶分子鉴定。
4.权利要求1所述的内参内置型双荧光素酶报告载体，用于测量微小RNA的生物学活性。
5.权利要求1所述的内参内置型双荧光素酶报告载体表达活性的评价方法，其特征 为，在哺乳动物细胞系中转染不同浓度的该报告载体，通过检测荧光素酶活性来测试其表 达特性以及线性范围。
6.如权利要求5所述的评价方法，其特征在于，哺乳动物细胞系包括人宫颈癌Hela细 胞，非洲绿猴肾细胞Vero，小鼠肌原细胞C2C12。
全文摘要
本发明公开了一种内参内置型双荧光素酶报告载体及其应用。萤火虫荧光素酶基因融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因和氨苄青霉素抗性基因之间，两种荧光素酶处于同一个载体上，萤火虫荧光素酶基因作为内参。利用一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法,将萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因置于同一个载体上,同时在海肾荧光素酶基因的3’非翻译区引入单克隆位点以方便目的片段的克隆,由此构建成内参内置型的双荧光素酶报告载体。本发明具有重复性高,复孔变异小,操作简便,定量准确的优点。本发明适用于微小RNA靶分子的筛选、鉴定和确认,也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化。
文档编号C12N15/52GK102094037SQ20101058367
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者乔宪凤, 刘西梅, 华再东, 华文君, 周荆荣, 姜黎, 张立萍, 李莉, 欧阳辉伍, 毕延震, 潘文, 肖红卫, 邵长伟, 郑新民, 魏庆信 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所