专利名称：表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株(rDEVul41HA)及其构建 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地涉及重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗领域。 本发明提供一种表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201026，命名为rDEVul41HA，及其构建方法和应用。
背景技术：
鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，又称鸭病毒性肠炎病毒。能引起鸭、 鹅和其它雁形目禽类发生急性、热性、败血性为特征的烈性传染病。但对DEV的研究相对于其它疱疹病毒而言相对比较少。故第八次国际病毒学分类委员会报告将其分类为疱疹病毒 [1]，而未能进一步将其进行分类。直到最近，其全序列才被全部测通[2]。自2007年，本研究室开始了 DEV疫苗株基因组的测序工作，通过构建DEV疫苗株全基因组粘粒文库，分段对其进行测序和分析，至2009年中期，已将DEV疫苗株全基因组测序工作完成。几乎同时，Li等也报道了 DEV疫苗株全基因组的测序和分析结果，其基因组大小约为158Kb，约编码78个蛋白。通过对DEV疫苗株基因组基因构成及结构分析，DEV被认为是α疱疹病亚科中的中间型病毒，与水痘病毒属成员更为相近β]。而同为禽类疱疹病毒的马立克病毒(MDV)和火鸡疱疹病毒(HTV)属于马立克病毒属，鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鹦鹉疱疹病毒O3SHV) 为传染性喉气管炎病毒属。
自上世纪80年代成功利用痘苗病毒为载体表达单纯疱疹病毒的TK基因以来，人们开始尝试用各种不同DNA病毒为载体，表达不同外源基因，并将构建的重组疫苗用于人和各种不同动物疾病的预防。大量的研究结果表明，疱疹病毒因其基因组大，可供外源基因插入或替代的非必需基因多，被认为是一种良好的构建重组活疫苗的病毒载体。截止目前， 已有大量的相关研究报道。在常见畜禽疱疹病毒疾病中，如以伪狂犬病毒(PRV)为载体， 分别在gD、gE、gG和TK等基因中插入CSF的E2等外源基因，并用其免疫猪，取得了良好的免疫效果[4-"]。用在鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的ULO和UL50中分别插入不同HA基因构建成功的重组病毒免疫鸡，均效果良好[11 ]。同样，Sakaguchi M(1993 ；1994)和Sonoda K (1996)等分别在MDVl的US10、US3、IRL中插入Lac Z基因，用其免疫1日龄无特定病原鸡 (SPF鸡)，1周后用vMDV、vvMDV攻毒，其对SPF鸡的保护效率为80 100% [.16]；在MDVl 的USlO中插入NDV F基因、在US2中插入IBDV VP2基因的重组病毒对MDV强毒的保护效率与对照MDVl相当[17,18] ；Tsukamoto K等(2002)以Pec作为传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因的启动子插入火鸡疱疹病毒(HVT)的UL45和UL46基因之间成功构建重组病毒，用其免疫的SPF鸡足以抵抗IBDV强毒的攻击[19]。现在，我国用于鸭瘟预防的疫苗主要是上世纪60年代研究成功的鸡胚弱化活疫苗。作为α疱疹病亚科一员，DEV也应该是一种良好的构建重组活疫苗的病毒载体。但DEV的基因组成及结构与MDV等有着较大的差异，如 MDV的基因组结构为TRL-UL-IRL-IRS-US-TRS，而DEV基因组的结构是UL-IRS-US-TRS。且 DEV与同亚科的另外几种畜禽疱疹病毒在动物体内生长复制的生物学特点也不尽相同。因3此，在PRV、MDV、ILTV中可稳定插入外源基因的位点不一定适用于DEV。
由于对DEV的研究相对滞后，至今为止，国内外关于DEV基因中复制非必需区的研究报道仍是空白。常用于构建疱疹病毒重组病毒的方法有三种。一种是同源重组；第二种是将病毒基因组插入BAC中，然后在BAC上构建突变，用其转染相应细胞拯救出重组病毒； 第三种是将含有相互重叠区的疱疹病毒基因片段分别插入粘粒中，并在其相应区段上构建突变，再用其共转染相应细胞拯救出重组病毒。然而对于DEV这种基础研究缺乏、分类不清楚、非必需基因未知的病毒而言，用第一或第二种方法构建重组病毒工作量大，且效率低。 而第三种方法的难点在于多粘粒感染性克隆的建立，如果这个平台构建成功，将能快速有效的构建重组病毒。至今，疱疹病毒的这种感染性克隆构建技术已比较成熟，且已见诸报道[20-27]O
本研究室在前期研究中，在鸭病毒性肠炎病毒的基因组中鉴定出可供外源基因稳定插入的复制非必需区。在此基础之上，本研究将目前中国用于禽流感预防的疫苗株血凝素(HA)基因插入DEV基因组的UL41基因中，用其免疫无特定病原鸭(SPF鸭)能使SPF 鸭产生良好的对抗流感的抗体，同时还不影响DEV的免疫效果。发明内容
本发明提供一种表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCC V201026，命名为rDEVul41Ha，及其构建方法和应用。具体地， 本发明利用重组克隆技术，将包含禽流感病毒血凝素(HA)基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-HA(所述基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO 1)插入到鸭肠炎病毒(duck enteritisvirus，DEV)的UL41基因中，构建获得在UL41基因中插入SV40-HA表达框的粘粒pF0Slul41SV40HA，由其拯救获得表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201026，命名为rDEVul41HA。本发明还涉及构建该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，以及该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株用于制备预防鸭病毒性肠炎和禽流感的疫苗的应用。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供一种表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCCV201(^6，命名为rDEVul41HA，其于 2010年10月沈日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)。所述表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201(^6在鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的UL41基因(SEQ ID NO 5)中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-HA(SEQID NO :1)。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供构建表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201026的方法，所述方法包括下述步骤
(1)构建鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因组的R)smid文库，并从中选择用于拯救鸭病毒性肠炎病毒的5粘粒组合系统，将它们分别命名为pF0Sl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5， 其中pFOSl粘粒包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的UL41基因；
(2)利用步骤(1)中获得的包含DEV基因组中的UL41基因的粘粒PFOS 1，在该粘粒的UL41基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段 SV40-HA(SEQ ID NO 1)，构建重组突变粘粒；和
(3)利用步骤O)中获得的重组突变粘粒和步骤(1)中获得的5粘粒组合系统中的pF0S2、pF0S3、pF0S4和pF0S5共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，拯救出重组病毒株CCTCC V201026，将其命名为 rDEVul41HA。
在优选的实施方案中，上述步骤(1)中得到的5粘粒克隆所包含的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段两端都含有Fse I-SbfI-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒全基因组(它们的重叠和覆盖模式可参见图9)。
在优选的实施方案中，上述步骤(2)中的禽流感病毒血凝素HA基因是已缺失掉碱性裂解位点的HA基因，其由2006年从安徽分离的H5W型禽流感毒株(其详细名称为A/ duck/Anhui/106/2006(H5Nl)，由本发明人所在的国家禽流感参考实验室保存，该实验室是国内合法保存禽流感病毒的机构)扩增得到；上述步骤( 中的SV40启动子序列来源于包含SV40启动子的质粒，例如，pSI质粒(购自Promega公司)等。
本发明所用的鸭病毒性肠炎病毒为DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222) (GeneBank EU082088)(中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)，目录编号AV1222 ；购自中国兽医药品监察所)。
在本研究中，本发明人发现，HA基因的插入位置不影响所构建的重组疫苗株对鸭病毒性肠炎病毒的免疫效果(数据未显示)。但HA基因插入其他位置，是否会影响其对鸭病毒性肠炎病毒的保护效果需要实验来证明。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供所述表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201026的应用，其用于制备预防鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒弓I起的传染病的疫苗。
在本发明的优选实施方案中，所述鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒引起的传染病包括鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒在鸭、鹅和其它雁形目禽类中引起的传染病，例如，由鸭病毒性肠炎病毒DEV引起的鸭病毒性肠炎，由禽流感病毒A/duck/LN/51/2005 (H5N1)和 A/duck/HuB/49/2005 (H5N1)等引起的禽流感等。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括本发明所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201026,以及药用佐剂、 赋形剂等。本领域技术人员根据所述疫苗的应用目的、进行免疫的禽类等因素，可以容易地选择适合的药用佐剂、赋形剂等。
在本发明的优选实施方案中，所述疫苗可以有效用于预防由鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒在鸭、鹅和其它雁形目禽类中引起的传染病，例如，有效用于预防由鸭病毒性肠炎病毒DEV引起的鸭病毒性肠炎，由禽流感病毒A/duck/LN/51/2005 (H5N1)和A/duck/ HuB/49/2005 (H5N1)等引起的禽流感等。
因此，本发明提供下述
1.表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为 CCTCC V201(^6，命名为 rDEVul41HA。
2.根据第1项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中在鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的UL41基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA 基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-HA，所述基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO :1。
3.根据第1项或第2项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述禽流感病毒血凝素HA基因是已缺失掉碱性裂解位点的血凝素HA 基因，其由H5m型禽流感毒株A/duck/Anhui/106/2006(H5Nl)扩增得到。
4.权利要求2所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段替换所述鸭病毒性肠炎病毒基因组的UL基因的第506到891位的核苷酸片段。
5.根据第2项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述SV40启动子序列来源于包含SV40启动子的质粒，例如pSI质粒。
6.构建第1项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，所述方法包括下述步骤
(1)构建鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的R)smid文库，并从中选择用于拯救鸭病毒性肠炎病毒的5粘粒组合系统，将它们分别命名为pF0Sl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5，其中pFOSl粘粒包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的UL41基因；
(2)利用步骤(1)中获得的包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的UL41基因的粘粒 pFOSl，在该粘粒的UL41基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-HA(SEQ ID NO :1)，构建重组突变粘粒；和
(3)利用步骤O)中获得的重组突变粘粒和步骤(1)中获得的5粘粒组合系统中的pF0S2、pF0S3、pF0S4和pF0S5共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，拯救出重组病毒株CCTCC V201026，将其命名为 rDEVul41HA。
7.根据第6项所述的方法，其中步骤(1)中得到的5粘粒组合系统中的每一个粘粒克隆所包含的DEV DNA片段两端都含有Fse I-Sbf I-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒全基因组。
8.第1项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的应用，其用于制备预防鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒引起的传染病的疫苗。
9.根据第8项所述的应用，其中所述鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒引起的传染病包括鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒在鸭、鹅和其它雁形目禽类中引起的传染病。
10. 一种疫苗，其包括第1项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，以及药用佐剂、赋形剂等。
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中
图 1 :PCClFos 粘粒图谱；
图2 拯救的病毒dDEV与亲本DEV疫苗株病毒基因组分别用BamH I.EcoR I.BbvC I酶切后的脉冲电泳图谱，其中DEV 亲本DEV疫苗株(即用于构建重组病毒的亲本病毒疫苗株)，dDEV:由本发明人构建和筛选的5粘粒系统(参见实施例1-3)拯救出的三株病毒， Ml 低范围 PFG 分子标记(Low Range PFG Marker) ；M2 :DL15000 分子标记；M3 λ -HindIII 消化分子标记(λ-Hind III digest Marker)；
图 3 :pUC ccdB kan 质粒图谱；
图 4 :pF0Slul41Kan ccdB 粘粒图谱；
图 5 :pENTR MCS 质粒图谱；
图6 :pSI HA质粒图谱；
图 7 :pENTR sv40_ha 质粒图谱；
图 8 :pF0Slul41SV40HA 粘粒图谱；
图9 鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆拯救重组病毒示意图10 重组病毒HA基因在CEF中的表达免疫荧光检测结果图11 =PCR检测外源表达框架在rDEVul41Ha中的情况；
图12 免疫重组病毒后，在SPF鸭体内诱导HI抗体的情况。
图13 =SEQ ID N0:1 :SV40_HA表达框架，其中斜体加粗部分为禽流感血凝素HA基因。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1. DEV疫苗株基因组R)smid文库的构建
按EPICENTRE 公司"CopyControl Fosmid Library Production Kit，，试剂盒说明书构建DEV基因组的R)smid文库。
方法如下将DEV 疫苗株病毒(CVCC AV 1222) (GeneBank EU082088)(中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)，目录编号AV1222 ；购自中国兽医药品监察所) DNA用物理方法即用25号针头(购自上海治宇医疗器械有限公司)抽吸多次进行切断处理，用T4DNA聚合酶(T4DNAPolymerase，购自New England Biolabs)及碱性磷酸酶 (AlkalinePhosphatase，购自New England Biolabs)对DNA片段进行末端平滑化及去磷酸化处理，脉冲电泳(用BiO-Rad公司CHEF Mapper XA Pulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为电泳缓冲液为0. &TBE，琼脂糖胶浓度为1%，程序为观-SOK)，回收 381Λρ-481Λρ之间的DNA片段。将回收后的DEV DNA片断两端用"Γ4连接酶连接上Fse I-Sbf I-Pme I接头，精制后连接到pCClR)s(购自EPICENTRE，图谱见图1)载体上，4°C过夜连接。 对混和液进行包装，转染大肠杆菌EPI300-T1 (购自EPICENTRE)。对文库滴度进行确认，其试验过程如下将包装好的混和液进行10倍梯度稀释，分别取10_2，ΙΟ"4, ΙΟ"5,10_6四个稀释度的稀释液10 μ 1感染100 μ 1ΕΡΙ300-Τ1细胞，将此菌涂于含12. 5 μ g/ml氯霉素的LB平板，37°C过夜培养，统计菌落数量，并计算其滴度，结果为3. 8xl05cfU/lib。即成功构建DEV 的fosmid文库。
实施例2.用于拯救DEV病毒粘粒的选择
文库构建成功后，挑取286个克隆提取粘粒，用碱裂解法[5]提取粘粒，送大连宝生物公司对插入PCC1R)S中的DEV DNA片段末端进行测序，测序引物序列如下
Primer 1 :5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’
Primer 2 :5’ -GCCAAGCTATTTAGGTGAGA-3’
经过末端测序的分析，共得到插入片段两端都连接有完整Fse I-SbfI-Pme I接头的克隆250个。从这250个克隆中选取多组用于拯救DEV的5粘粒组合。其中每组中克隆的DEV DNA片段两端都含有Fse I-SbfI-PmeI接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV基因组。7
实施例3.病毒拯救
用Qiagen公司的中量提取试剂盒提取所选择的粘粒的DNA。用Fse I.Sbfl或Rne I内切酶(均购自New England Biolabs)对所选择的粘粒进行线性化处理，反应条件如下 ^fI内切酶20U(也可以使用Fse I或Riie I内切酶)，粘粒10 μ g，37°C作用1小时，酚/ 氯仿抽提，乙醇沉淀制备转染用DEV DNA。
参照Reddy SM (2002)的磷酸钙方法将5段DEV DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞 (CEF)[28]，经多次重复，其中有3组5粘粒组合转染4-6天后可见CEF出现DEV病毒典型病变，选取重复性较好的一组5粘粒组合进行后续实验。收获此组5粘粒共转染拯救的病毒， 命名为dDEV，用此dDEV与亲本DEV病毒(即用于构建该感染性克隆的亲本病毒)分别接种次代CEF。
CEF的制备方法如下取9-10日龄SPF鸡胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭气室部位，脱碘后无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’ s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，并去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎。用0.25%的胰酶(4mL/胚)在37°C水浴中消化4_5分钟，弃去胰酶，用Hank’ s液洗涤2次。加入适量的含血清与双抗(青霉素100u/mL，链霉素IOOmg/ mL)的M199营养液(购自HyClone)，吹打使细胞分散，用四层纱布过滤后制成IO6-IO7细胞 /毫升的细胞悬液，最后分装于培养转瓶中37°C旋转培养。36-48小时后，按毒种细胞培养液体积为1 1000将病毒接种于CEF。待细胞病变达到100%时，收集培养液；4°C 6000g 离心10分钟，去除细胞碎片；取上清50000g离心2小时富集病毒；然后经20%和60%蔗糖密度梯度离心，50000g离心2小时，回收20%和60%中间层；之后经50000g离心2小时超速离心脱糖处理获得纯化好的病毒。提取病毒全基因组DNA[29]，分别用BamH I.EcoR I和 BbvC 1(均购自New EnglandBiolabs)对原疫苗株DEV和dDEV进行酶切。反应条件如下 分别取BamHI、EcoR I和BbvC I各20U，分别与DEV基因组DNA 8 μ g混和，于50 μ 1体系中37°C作用1小时。用Bio-Rad公司CHEF Mapper XA Pulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为电泳缓冲液位0. 5x TBE，琼脂糖胶浓度为1%，程序为I-70K。
拯获的病毒酶切图谱和亲本病毒相同，如图2所示。说明所选择的5粘粒组成功拯救DEV病毒。本发明人将所选择的5粘粒组成员分别命名为pF0Sl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、 PF0S5，该5粘粒克隆所包含的DEVDNA片段两端都含有Fse I-SbfI-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV基因组(它们的重叠和覆盖模式可参见图9)，并且其中pFOSl包含 DEV基因组的UL41基因(SEQ ID NO 5)。关于该5粘粒系统本发明人已经申请专利，申请号为201010207207. 8，题目为“鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性克隆系统及其构建方法和应用”，申请日期为2010年6月13日。
实施例4.在DEV基因组的UL41基因中插入SV40-HA表达框架(SEQ IDNO 1)的重组突变粘粒的构建
基于上述实施例1-3结果，在所选择的5粘粒组成员pFOSl中DEV基因组的UL41 基因中，具体为缺失UL41基因的第506到891位核苷酸，并代之以插入SV40-HA表达框架， 即SV40-HA表达框架替换所述UL基因(SEQ ID NO 5)的第506到891位的核苷酸片段(其中SV40-HA表达框架的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，其中包含SV40启动子，也参见图13，其中斜体加粗部分为HA基因(SEQ ID NO :4))，构建1个重组突变粘粒，pF0Slul41SV40HA (该突变粘粒的图谱如图8所示，其构建模式可参见图9)。在本研究中，本发明人发现，HA基因的插入位置不影响其对鸭病毒性肠炎病毒的免疫效果。但HA基因插入其他位置，是否会影响其对鸭病毒性肠炎病毒的保护效果需要实验来证明。
pF0Slul41SV40HA粘粒的构建过程简述如下
4. IpUC ccdB kan 的构建
用表1所示的三对引物(由TaKaRa公司合成)分别对hvitrogen公司Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2TlCompetent Cells 试剂盒中提供的“RfA”(其中基因为aatRl-氯霉素-ccdB-aatR2)基因(SEQ ID NO 2)进行多重 PCR扩增。
表1 用于克隆“Rfkan” (SEQ ID NO :3，其中基因为aatRl-卡那霉素 -ccdB-aatR2)基因的PCR引物
引物名称序列tRl5'- GCG TCT AGA ATC ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCT GAA CG-3' (XbaI)tR25'- GTG ATT TAAAT TCC ACA CAT TAT ACG AGC CGG-3'P6K15，-CCG GCT CGT ATA ATG TGT GGA ATT TAA ATC ACA TCT CAA CCATCATCG-3'P6K25'- CAG CGC GCA AAT ACG CAT ACA TTT AAA TCG AGC TCG AAT TCGATG AA-3'ccdBl5'- TCG ATT TAAATG TAT GCG TAT TTG CGC GCT G-3'ccdB25'- GCG AAG CTT ATC ACC ACT TTG TAC AAG AAA G-3' (HindIII)
其具体过程简述如下分别用tRl和tR2，以及ccdBl和ccdB2这两对引物从 Reading Frame Cassette A中扩增到aatRl基因及ccdB_aatR2基因，其反应条件为 950C 5min-35*(94°C 45s_54°C 45s_72°C 45s)-72°C IOmin0 然后用 P6K1 和 P6K2 这对引物从PM0D6质粒(购自EPICENTRE公司)中扩增到卡那霉素抗性基因，其反应条件为95°C 5m in-35*(94°C 45s-54°C 45s_72°C 45s)-72°C lOmin。分别纯化这三个片段DNA，并以此三个片段共同作为模板，以tRl和ccdB2作为引物，扩增得到RfKan基因(SEQ ID NO :3)，即其基因为 aatRl-卡那霉素-ccdB-aatR2，其反应条件为95°C 5min_35* (94°C 45s-54°C 45s_72°C 1. 5min)-72°C IOmin0
并将得到的"RfKan"利用XbaI和HindIII克隆入pUC 18载体(购自TaKaRa公司)中，获得pUC ccdB kan，如图3所示。
4. 2pF0Slul41Kan ccdB 粘粒的构建
用表2所示的引物UL41ccdl和UL41ccd2从上述构建的pUC ccdB kan中扩增带有重组臂的 ccdB基因，其反应条件为95°C 5min-35*(94°C 45s_54°C 45s_72°C 2min) -72°C 1Omin0 用 Gene Bridges 公司的 Counter-klection BAC Modification Kit 试剂盒将所扩增的片段克隆入PFOSl粘粒中，获得pF0Slul41Kan ccdB粘粒，即在pFOSl粘粒的UL41基因中插入ccdB和卡那霉素抗性基因，如图4所示。
表2 用于从pUC ccdB kan中扩增带有重组臂的ccdB基因的引物
引物名称序列UL4 Iccdl5 ’ -ATT GTC AAT CGG ATG AAT GCG TAC AGG AAG GCG ATG TAT GCC AGG AGT ATC ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCT G-3 ‘UL41ccd25 ’ - CAA CAC GGC ATG AAC AGA CTT CAG TAT AGG GTA GCG GTG TAAATC AGT ATC ACC ACT TTG TAC AAG AAA G-3 ’
4. 3pENTR MCS 质粒的构建
^jjJ i^f^^it,^., ^JfftM invitrogen ^W] Gateway Vector ConversionSystem with One Shot ccdB Survival 2TlCompetent Cells试剂盒中提供的pENTR-gus质粒(购自hvitrogen公司)做了以下改造将pENTR-gus中的gus基因删除，而加入了 BamHI、 BglII、EcoRI、EcoRV、SacI、SalI、KpnI 和 XbaI 八个酶切位点。
用表3所示的两条引物MCSl和MCS2，用点突变克隆试剂盒(购自hvitrogen公司)将pENTR-gus改造成pENTR MCS,如图5所示。
表3 用于将pENTR-gus改造成pENTR MCS的引物
权利要求
1.表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为 CCTCC V201026。
2.权利要求1所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株， 其中在鸭肠炎病毒DEV的UL41基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段，所述基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO :1。
3.根据权利要求1或2所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述禽流感病毒血凝素HA基因是已缺失掉碱性裂解位点的血凝素HA基因， 其由H5m型禽流感毒株A/duck/Anhui/106/2006(H5N 1)扩增得到。
4.权利要求2所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株， 其中所述包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段替换所述UL基因的第506到891位的核苷酸片段。
5.根据权利要求2所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述SV40启动子序列来源于包含SV40启动子的质粒，例如pSI质粒。
6.构建权利要求1所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，(1)构建鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的R)smid文库，并从中选择用于拯救鸭病毒性肠炎病毒的5粘粒组合系统，将它们分别命名为pFOSl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5，其中 pFOSl粘粒包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的UL41基因；(2)利用步骤(1)中获得的包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的UL41基因的粘粒 pFOSl，在该粘粒的UL41基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段SEQ ID NO :1，构建重组突变粘粒；和(3)利用步骤O)中获得的重组突变粘粒和步骤(1)中获得的5粘粒组合系统中的 pF0S2、pF0S3、pF0S4和pF0S5共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，拯救出重组病毒株CCTCC V201026，将其命名为 rDEVul41HA。
7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤(1)中得到的5粘粒组合系统中的每一个粘粒克隆所包含的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段两端都含有Fse I-Sbf I-Pme I接头，相互重叠，并且拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒全基因组。
8.权利要求1所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的应用，其用于制备预防鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒引起的传染病的疫苗。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒引起的传染病包括鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒在鸭、鹅和其它雁形目禽类中引起的传染病。
10.一种疫苗，其包括权利要求1所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201026,以及药用佐剂、赋形剂等。
全文摘要
本发明提供一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201026，命名为rDEVul41HA，及其构建方法和应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-HA插入到鸭病毒性肠炎病毒的UL41基因中，构建获得在UL41基因中插入SV40-HA表达框的粘粒，由其拯救获得表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201026。本发明还涉及构建该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，以及该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株用于制备预防鸭病毒性肠炎和禽流感的疫苗的应用。
文档编号C12N7/01GK102533674SQ20101059238
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者姜永萍, 柳金雄, 步志高, 陈化兰 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所