专利名称：防治大肠杆菌病的卵黄抗体及其制备方法和饲料添加剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治大肠杆菌病的卵黄抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术：
大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起，为对养禽业危害最为严重的疫病之一，目前，对大肠杆菌病的预防主要采用疫苗和抗菌药物。但大肠杆菌血清亚型众多，各血清型间的交叉免疫效果不佳，给疫苗和药物的预防带来一定困难。大肠杆菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，可加快巨噬细胞对抗原的提呈作用， 激活淋巴细胞的增殖反应，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫；大肠杆菌的菌毛蛋白也具有良好的免疫原性，给机体免疫后能产生相应的菌毛抗体，而且更为重要的是大肠杆菌的外膜蛋白和菌毛蛋白在不同血清型菌株间均具有交叉保护作用，能抵抗同源和异源菌株的攻击。两种蛋白在目前一些大肠杆菌病的防治中都具有重要的应用价值。卵黄抗体(IgY)是禽类的一种免疫球蛋白，来源于血液，由卵泡选择性地将血液中的抗体主动转运到卵黄当中，具有IgG的典型构象，已广泛地用于畜禽病毒性和细菌性传染病的防控。实验证明卵黄抗体中的IgY浓度长期维持在相当于或高于血液浓度的水平，并且具有高度的稳定性，对热、酸、碱环境具有良好的耐受性。利用禽类规模化生产特异性免疫抗体，不仅成本低、特异性抗体效价高、安全性好，长期使用也不会使菌株产生耐药性，而且极为实用，易于推广，是一种安全、绿色、高效的新型生物制品。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以有效防治多血清型大肠杆菌病的卵黄抗体，该卵黄抗体是利用提取的禽致病性大肠杆菌O78 (Avian pathogenic Escherichia coIiAPEC O78) 的外膜蛋白和菌毛蛋白混合液作为免疫抗原免疫鸡制备而成，此种卵黄抗体的免疫原性好，保护效率高，可针对多血清型的大肠杆菌，且无毒副作用，经济实用，易于推广。本发明的另一目的是提供该卵黄抗体的制备方法和应用。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种防治大肠杆菌病的卵黄抗体，其特征在于以禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白与菌毛蛋白混合液作为抗原，加入油佐剂免疫鸡制备而成。其中，作为抗原的混合液中，禽致病性大肠杆菌O78外膜蛋白与菌毛蛋白的体积比为 1 1。本发明的卵黄抗体，抗原与油佐剂的体积比为1 1 1.5。其中，油佐剂由白油94% (ν/ν)、司本-806% (ν/ν)和硬脂酸铝2% (g/v)组成。本发明还提供了该防治大肠杆菌病的卵黄抗体的制备方法，其制备步骤如下(1)大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白的提取将禽致病性大肠杆菌O78划线接种于LB平板，37°C培养18小时，挑取单个菌落，接种3mL LB肉汤，37°C振荡培养15小时，然后取2mL LB培养液接种于200mL LB肉汤，继续培养15小时，收集菌液分别进行外膜蛋白和菌毛蛋白的提取，然后分别稀释至200-300 μ g/ mL，_20°C保存备用；(2)免疫用混合抗原的制备将相同浓度的外膜蛋白与菌毛蛋白以体积比为1 1混合均勻，然后按配比加入油佐剂，乳化分装备用；(3)产蛋鸡的免疫选用25周龄、大肠杆菌抗体阴性的健康经产蛋鸡，胸肌分点注射免疫制备的外膜蛋白和菌毛蛋白的混合抗原，免疫剂量为1. OmL/只，于首免后7天和14天时以同样剂量加强免疫，经3次免疫后7天收集鸡蛋，4°C保存备用；(4)卵黄抗体的获取采用水洗法从卵黄中提取卵黄抗体并进行透析纯化，然后以还原性和非还原性 SDS-PAGE电泳检测其大小和纯度。本发明的防治大肠杆菌病的卵黄抗体还可添加到食品、保健中或作为饲料添加剂添加到饲料中，或制备多血清型大肠杆菌病制剂，从而防治多血清型大肠杆菌病。其中，本发明所采用的禽致病性大肠杆菌O78(Avian pathogenic Escherichiacoli APEC O78)购买自中国兽医药品监察所，也可以使用任何一株当前中国国内公开的大肠杆菌菌株，不同的禽致病性大肠杆菌O78菌株不影响本发明的实施；制备卵黄抗体的过程中所使用的鸡可根据不同应用途径选择合适的鸡群，如用于治疗目的的卵黄抗体可以选用SPF鸡，预防性目的的卵黄抗体可以选用商品蛋鸡，也可以使用鸭等其他家禽。本发明首次以禽致病性大肠杆菌Ore的外膜蛋白和菌毛蛋白混合液作为抗原制备大肠杆菌的卵黄抗体，充分利用了大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白的高度保守性、强的免疫原性以及两种蛋白在大肠杆菌不同血清型间的广泛交叉保护作用，该方法所制备的卵黄抗体可以用于多血清大肠杆菌病的预防和治疗，同时也可以作为食品、保健品添加剂、饲料添加剂或用于制备检测大肠杆菌感染引起的相关疾病的制剂。本发明的卵黄抗体安全且保护效率高，对同型禽致病性大肠杆菌(O78)的攻击保护率达90%，对Op O2血清型禽致病性大肠杆菌的保护率也能达70%以上，该产品经济实用，易于产业化推广，能弥补抗生素和疫苗实际应用中的不足。
图1非还原型卵黄抗体IgY的SDS-PAGE图片图2还原型卵黄抗体IgY的SDS-PAGE图片
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1免疫用大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白混合抗原和大肠杆菌卵黄抗体的制备1、免疫用大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白混合抗原的制备(1)大肠杆菌外膜蛋白的提取
禽致病性大肠杆菌O78菌株划线接种于LB平板，37°C培养18小时，挑取单个菌落， 接种3mL LB肉汤37°C振荡培养15小时，然后取2mL LB培养液接种于200mL LB肉汤，继续培养15小时，取菌液4°C 6000g离心lOmin，弃上清，将沉淀悬浮于10mmol/L HEPES (pH7. 4) 中，50%输出功率超声裂解60s，裂解物于4°C 6000g离心lOmin，收集上清液加入约8倍体积的2%十二烷酰肌氨酸钠溶液，室温作用20min，于10°C 12000g离心1小时，将沉淀悬浮于 10mmol/LHEPES(pH7. 4) ImL 中，调整至浓度为 200 μ g/mL，置 _20°C备用。
(2)大肠杆菌菌毛蛋白的提取禽致病性大肠杆菌O78菌株划线接种于LB平板，37°C培养18小时，挑取单个菌落，接种3mL LB肉汤37°C振荡培养15小时，然后取2mL LB培养液接种于200mLLB肉汤， 继续培养15小时，取菌液4°C 6000g离心lOmin，弃上清，沉淀以PBS悬浮后60°C水浴振荡 30min,经高速搅拌20min，IOOOOg 4°C离心20min，取上清液加入等体积饱和硫酸铵溶液， 4°C过夜；盐析产物经IOOOOg 4°C离心15min，收集沉淀，PBS悬浮，透析48小时，8000g°C离心15min，上清液即为含菌毛蛋白的溶液，调整至浓度为200μ g/mL，置-20°C备用。(3)等体积混合外膜蛋白和菌毛蛋白抗原，加入佐剂；以体积比为1 1混合大肠杆菌的外膜蛋白和菌毛蛋白抗原，混合均勻后，以抗原佐剂为1 1 (ν/ν)加入油佐剂，乳化。2、大肠杆菌卵黄抗体的制备(1)基础免疫选用25周龄、大肠杆菌抗体阴性的健康经产蛋鸡，胸肌分点注射制备的大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白的混合油佐剂抗原ImL/只；(2)强化免疫基础免疫后7天和14天时加强免疫，分别胸肌分点注射制备的大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白的混合油佐剂抗原ImL/只，经3次免疫后7天收集鸡蛋，4°C保存。(3)卵黄抗体的获取收集免疫鸡所产的蛋，先用自来水洗去蛋壳表面的污物，再浸入0.5%的新洁尔灭溶液消毒30min，然后取出，用酒精棉擦拭蛋壳，去除蛋壳，无菌取出卵黄，加4倍灭菌去离子水，以0. lmol/L HCl调pH值至5. 0，再加NaCl和PEG6000分别至5g/kg和35g/kg，搅拌后静置，8000g离心lOmin，上清液加PEG6000至终浓度120g/kg，以0. lmol/L NaOH调pH值至6. 8，搅拌、静置后同上离心20min，最后将沉淀悬浮于少量PBS中(通常为原卵黄抗体体积的1/10)，悬浮液转入透析袋中用50倍体积的PBS透析过夜，最后以0. 45 μ m的滤膜过滤除菌，按每毫升卵黄抗体加入青霉素1000U、链霉素1000 μ g，并按总量的0. 01%加入硫柳汞制成卵黄抗体液，保存于-20°C备用。(4)卵黄抗体的SDS-PAGE电泳检测应用SDS-PAGE电泳检测卵黄抗体的大小及纯度。方法分别配制10%和15%的蛋白胶进行还原IgY和非还原IgY电泳，将纯化后的IgY抗体与上样缓冲液按4 1体积混合，其中还原IgY电泳的上样缓冲液中加有DTT，100°C煮沸3min，12000g离心5min，上样量为15 μ L，用衡压10V的电压进行电泳，待澳酚兰迁移至距凝胶下端约Icm处结束电泳。 将凝胶浸没于染色液(含0. 考马斯亮蓝RZ50，45%甲醇和0. 冰乙酸)中振荡染色1 小时，弃染色液后加脱色液(含0. 75%冰乙酸和5%甲醇)，每30min更换脱色液直至背景清晰。结果未加DTT的非还原IgY可清晰见到约180kDa的条带，而加有DTT的还原性IgY 主要由2条链组成，重链分子量约66kDa，轻链约25kDa。结果见图1、2。(5)卵黄抗体的无菌检验在无菌条件下吸取1 mL高免卵黄液，加入3mL蒸馏水，混勻后分别接种于普通琼脂斜面、厌氧肉肝汤和马丁氏肉汤中，37°C下培养48小时后，涂片、进行镜检，结果卵黄抗体在三种培养基上均未见有细菌生长。(6)卵黄抗体的安全检验选择20日龄健康肉鸡20只，随机分为2组，第一组10只，每只皮下注射高免卵黄抗体lmL，另一组10只不注射任何试剂作为对照，同条件下饲养，连续观察2周，注射组肉鸡同对照组肉鸡一样未出现任何由于注射卵黄抗体而引起的不适症状，均健康存活，说明该卵黄抗体安全。实施例2免疫用大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白混合抗原和大肠杆菌卵黄抗体的制备1、免疫用大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白混合抗原的制备(1)大肠杆菌外膜蛋白的提取禽致病性大肠杆菌O78菌株划线接种于LB平板，37°C培养18小时，挑取单个菌落， 接种3mL LB肉汤37°C振荡培养15小时，然后取2mL LB培养液接种于200mL LB肉汤，继续培养15小时，取菌液4°C 6000g离心lOmin，弃上清，将沉淀悬浮于10mmol/L HEPES (pH7. 4) 中，50%输出功率超声裂解60s，裂解物于4°C 6000g离心lOmin，收集上清液加入约8倍体积的2%十二烷酰肌氨酸钠溶液，室温作用20min，于10°C 12000g离心1小时，将沉淀悬浮于 10mmol/LHEPES(pH7. 4) ImL 中，调整至浓度为 300 μ g/mL，置 _20°C备用。(2)大肠杆菌菌毛蛋白的提取禽致病性大肠杆菌O78菌株划线接种于LB平板，37°C培养18小时，挑取单个菌落，接种3mL LB肉汤37°C振荡培养15小时，然后取2mL LB培养液接种于200mLLB肉汤， 继续培养15小时，取菌液4°C 6000g离心lOmin，弃上清，沉淀以PBS悬浮后60°C水浴振荡 30min,经高速搅拌20min，IOOOOg 4°C离心20min，取上清液加入等体积饱和硫酸铵溶液， 4°C过夜；盐析产物经IOOOOg 4°C离心15min，收集沉淀，PBS悬浮，透析48小时，8000g°C离心15min，上清液即为含菌毛蛋白的溶液，调整至浓度为300μ g/mL，置-20°C备用。(3)等体积混合外膜蛋白和菌毛蛋白抗原，加入佐剂；以体积比为1 1混合大肠杆菌的外膜蛋白和菌毛蛋白抗原，混合均勻后，以抗原佐剂为1 1.5 (ν/ν)加入油佐剂，乳化。2、大肠杆菌卵黄抗体的制备(1)基础免疫选用25周龄、大肠杆菌抗体阴性的健康经产蛋鸡，胸肌分点注射制备的大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白的混合油佐剂抗原ImL/只；(2)强化免疫基础免疫后7天和14天时加强免疫，分别胸肌分点注射制备的大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白的混合油佐剂抗原ImL/只，经3次免疫后7天收集鸡蛋，4°C保存。(3)卵黄抗体的获取
收集免疫鸡所产的蛋，先用自来水洗去蛋壳表面的污物，再浸入0.5%的新洁尔灭溶液消毒30min，然后取出，用酒精棉擦拭蛋壳，去除蛋壳，无菌取出卵黄，加4倍灭菌去离子水，以0. lmol/L HCl调pH值至5. 0，再加NaCl和PEG6000分别至5g/kg和35g/kg，搅拌后静置，8000g离心lOmin，上清液加PEG6000至终浓度120g/kg，以0. lmol/L NaOH调pH值至6. 8，搅拌、静置后同上离心20min，最后将沉淀悬浮于少量PBS中(通常为原卵黄抗体体积的1/10)，悬浮液转入透析袋中用50倍体积的PBS透析过夜，最后以0. 45 μ m的滤膜过滤除菌，按每毫升卵黄抗体加入青霉素1000U、链霉素1000 μ g，并按总量的0.01%加入硫柳汞制成卵黄抗体液，保存于-20°C备用。卵黄抗体的SDS-PAGE电泳检测、无菌、安全检验过程及结果同实施例1。实施例3大肠杆菌混合卵黄抗体的保护试验取5 10日龄的雏鸡60只进行雏鸡感染和治疗试验，将雏鸡随机分为3组，每组 20只，第一组攻击禽致病性大肠杆菌O78，第二组攻击禽致病性大肠杆菌O1,第三组攻击禽致病性大肠杆菌O2，均采用颈部皮下注射的方式攻毒，剂量均为5 X IO7CFU/只，在攻毒后36 小时分别从每组随机抽取10只，以实施例1制备的高免卵黄抗体治疗，每只颈部皮下注射 2mL卵黄抗体，每组另外的10只用于不做治疗的对照，不注射任何试剂，观察每组动物的死亡情况，计算死亡率，评价卵黄抗体的治疗效果。结果，5 8天内，对照组的鸡全部发病或死亡，剖检可见严重的心包炎，肝或胸膜发生粘连。而注射卵黄抗体的治疗组对禽致病性大肠杆菌078、O1, O2三种血清型的保护率分别为90%、70%、80%。具体见表1。表1卵黄抗体对雏鸡的保护情况
权利要求
1.一种防治大肠杆菌病的卵黄抗体，其特征在于以禽致病性大肠杆菌O78外膜蛋白与菌毛蛋白混合液作为抗原，加入油佐剂免疫鸡制备而成。
2.如权利要求1所述的防治大肠杆菌病的卵黄抗体，其特征在于，作为抗原的混合液中，禽致病性大肠杆菌O78外膜蛋白与菌毛蛋白的体积比为1 1。
3.如权利要求1所述的防治大肠杆菌病的卵黄抗体，其特征在于抗原与油佐剂的体积比为1 1 1. 5。
4.如权利要求1所述的防治大肠杆菌病的卵黄抗体，其特征在于油佐剂的组成如下 白油94% (ν/ν)、司本-80 6% (ν/ν)和硬脂酸铝2% (g/v)。
5.如权利要求1-4任一项所述的防治大肠杆菌病的卵黄抗体的制备方法，其制备步骤如下(1)大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白的提取将禽致病性大肠杆菌O78划线接种于LB平板，37°C培养18小时，挑取单个菌落，接种 3mL LB肉汤，37°C振荡培养15小时，然后取2mL LB培养液接种于200mL LB肉汤，继续培养15小时，收集菌液分别进行外膜蛋白和菌毛蛋白的提取，然后分别稀释至200-300 μ g/ mL，_20°C保存备用；(2)免疫用混合抗原的制备将相同浓度的外膜蛋白与菌毛蛋白以体积比为1 1混合均勻，然后按配比加入油佐齐U，乳化分装备用；(3)产蛋鸡的免疫选用25周龄、大肠杆菌抗体阴性的健康经产蛋鸡，胸肌分点注射免疫制备的外膜蛋白和菌毛蛋白的混合抗原，免疫剂量为1. OmL/只，于首免后7天和14天时以同样剂量加强免疫，经3次免疫后7天收集鸡蛋，4°C保存备用；(4)卵黄抗体的获取采用水洗法从卵黄中提取卵黄抗体并进行透析纯化，然后以还原性和非还原性 SDS-PAGE电泳检测其大小和纯度。
6.如权利要求1-4任一项所述的防治大肠杆菌病的卵黄抗体在制备防治多血清型大肠杆菌病制剂及保健品、食品或饲料添加剂中的应用。
全文摘要
本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及一种防治大肠杆菌病的卵黄抗体及其制备方法和应用。本发明是以提取的禽致病性大肠杆菌O78外膜蛋白和菌毛蛋白混合液作为抗原免疫鸡制备的大肠杆菌卵黄抗体，实验表明本发明的卵黄抗体安全、高效，对同型和多种异型大肠杆菌的保护效果均良好。本产品可以用于多血清型大肠杆菌病的预防和治疗，同时也可以作为保健品、食品和饲料的添加剂或用于制备检测大肠杆菌感染引起的相关疾病的制剂。
文档编号A23L1/30GK102532311SQ201010612418
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者卢会英, 杜金玲, 牟巍, 王勇鹣, 赵亚荣, 郭书豪 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司