通过发酵条件改变酶平衡的制作方法

专利名称：通过发酵条件改变酶平衡的制作方法
技术领域：
本教导内容涉及改善的蛋白质从细胞培养物的生产的方法，特别涉及可优选的增加从处于木聚糖酶基因启动子序列控制下的基因生产的蛋白质表达的培养组分和条件。改善的方法可用于生产具有增强的木聚糖酶和半纤维素水解活性的纤维素酶组合物。III、简介生物质的主要组分是纤维素和半纤维素。纤维素由组织成更有序的原纤维结构的 β-1，4-连接的葡萄糖残基的聚合物组成。木聚糖在植物细胞壁中几乎与纤维素一样普遍， 主要含有如纤维素中连接的β-D-木糖单位。一些木聚糖含有其他糖类，例如L-阿拉伯糖， 但其形成分支，而不是主链的一部分。纤维素和半纤维素可以转化为糖，例如葡萄糖，并出于工业目的被多种微生物用作能源，所述微生物包括细菌、酵母和真菌。纤维素物质还可以被可商购的酶转化为糖，所获得的糖可用作工业微生物的原料，来生产产品，例如塑料和乙醇。丝状真菌——里氏木霉 (Trichoderma reesei)，是纤维素酶的有效生产者。已探索了此类里氏木霉生产这些酶的能力。然而，现有的纤维素酶产品一般缺少完全水解半纤维素物质的能力，其中一些半纤维素物质在生物质组合物中仍然是未消耗的，并可能干扰生物质的处置和处理。里氏木霉蛋白质的纤维素水解混合物是微生物的最有特色的纤维素水解通路之一。包含这些混合物的纤维素酶分为两大主类内切葡聚糖酶(EG)和纤维二糖水解酶 (CBH)。β-葡糖苷酶(BGL)也是里氏木霉的纤维素酶混合物的一部分。在转录水平协调和调控包含纤维素酶系统的基因的表达。该系统的成员协同作用，并且如上所述，是纤维素有效水解为可溶性寡糖所必需的。木霉中主要纤维素酶基因(Cbhl，CWi2，egll和egU)和木聚糖酶基因(xynl，xyn2 和xyn3)的表达和生产依赖于生长可利用的碳源。纤维素酶基因受葡萄糖的严密抑制，并可以被纤维素或二糖槐糖(sophorose)诱导数千倍。实际上，相比含有葡萄糖的培养基，在含有诱导性碳源(例如纤维素或槐糖)的培养基上，主要的纤维二糖水解酶I(CBHl)的表达水平被上调数千倍(Ilmen 等人，App. Environ. Microbio.，1298-1306，1997)。三种主要类型的木聚糖酶(xynl，xyn2和xyn3)不是共调控的。研究已显示， xynl和xyn2的表达以不同的方式调控，即，在存在木聚糖和木糖的条件下诱导xynl， 槐糖轻微的诱导xynl，而xyn2则非特异性的同时受木聚糖酶和纤维素酶诱导物的影响 (Zeilinger等人，1996 ；March等人，1996，Xu等人，1998)。第三种木聚糖酶xyn3则完全不受该酶的底物——木聚糖的诱导，而受纤维素及其衍生物的诱导(Xu等人，Appl Microbiol Biotechnol. 2000. 54 :370-375, Furukawa, Fungal Genetics and Biology.2008.45 1094-1102)。此外，高浓度的葡萄糖已知抑制xynl的表达。因而，本公开内容展现了令人惊讶的发现，即加工的葡萄糖和木糖诱导纤维素酶和木聚糖酶的表达，即使本领域已知葡萄糖和木糖不利于纤维素酶和木聚糖酶的活性。
现有的混合纤维素酶产品缺少水解半纤维素物质的优化系统。所需要的是共同生产或混合优化组合的酶，所述酶组合能够降解生物质底物的纤维素的和半纤维素的组分。 对产生纤维素酶和木聚糖酶的平衡混合物的商业实践方法也存在进一步的需求。IV、概述现已发现将转糖基化酶在升高的温度下孵育在浓缩的葡萄糖溶液中产生加工的葡萄糖溶液，当与戊糖(例如木糖)组合时，产生能够诱导表达平衡的纤维素水解和半纤维素水解的酶掺合物的混合的糖类组合物。令人惊讶的是，所获得的混合的糖类组合物足以诱导纤维素酶和木聚糖酶的生产，而不需要进一步的纯化。该发现令人惊讶之处在于葡萄糖在里氏木霉中作为纤维素酶和某些木聚糖酶基因的阻抑物发挥作用。该发现提供了纤维素酶和半纤维素酶基因表达的诱导物，是纯化的糖类诱导物和纤维素酶和木聚糖酶分离生产的廉价替代物。本发明的一个方面提供了制备混合的糖类组合物的方法，所述方法包括(a)将葡萄糖溶液与转糖基化酶混合，产生酶-葡萄糖混合物；(b)在升高的温度下孵育酶-葡萄糖混合物一定时间，所述时间足以产生包含至少一种寡糖的加工的葡萄糖混合物；(C)将加工的葡萄糖混合物与戊糖混合，产生混合的糖类组合物。本公开内容的另一个方面提供了制备酶组合物的方法，包括(a)将葡萄糖溶液与转糖基化酶混合，产生酶-葡萄糖混合物；(b)在升高的温度下孵育酶-葡萄糖混合物一定时间，所述时间足以产生包含至少一种寡糖的加工的葡萄糖混合物；(c)将加工的葡萄糖混合物与戊糖混合，产生混合的糖类组合物；和(d)在有益于蛋白质表达的条件下，将丝状真菌暴露在混合的糖类组合物中，产生酶组合物。优选的，所述酶组合物包含70%至 98%的纤维素酶和2%至30%木聚糖酶。在某些实施方案中，所述有益于蛋白质表达的条件包括在约25°C和约30°C之间的温度。在其他实施方案中，所述有益于蛋白质表达的条件包括酸性条件，特别是在约4. 0和约6. 0之间的pH、更特别的是在约4. 4和约5. 5之间的 pH、最特别的是在约pH4. 8和约pH5. 5之间。在某些实施方案中，所述葡萄糖溶液包含从约5%至约75% (wt/wt)，更优选从约 50%至约75% (wt/wt)的葡萄糖。所述转糖基化酶可以是分类在EC 2.4中的酶，或者分类在EC 3.2中的酶。在优选的实施方案中，所述转糖基化酶是葡糖苷酶或内切葡聚糖酶。在某些实施方案中，所述升高的温度是从约50°C至约75°C。所述酶-葡萄糖混合物可以孵育8小时至500小时，更优选48小时至72小时。在优选的实施方案中，所添加的戊糖是木糖，更优选的在混合的糖类组合物中添加的终浓度是从约lg/L至约50g/L。更优选的，木糖在混合的糖类组合物中的浓度是从约5g/L至约20g/L。在一个实施方案中，戊糖是黑液(black liquor)。本公开内容的另一个方面提供了酶组合物，包括以下物质、由以下物质制备，或可通过混合以下物质获得(a) —种或多种的木聚糖酶，其中至少一种所述一种或多种的木聚糖酶是XYN2或XYN3 ；和(b) —种或多种的纤维素酶，其中至少一种所述一种或多种的纤维素酶是CBH1、CBH2或BGLl ；其中所述酶组合物包括比例为约0. 5至约1. 0的木聚糖酶比纤维素酶(w/w)，或比例为约0. 05至约1. 5的木聚糖酶比CBHl (w/w)。本教导内容的其它方面提供了根据本文公开的方法生产的混合的糖类组合物，根据本文公开的方法生产的酶组合物，和降解生物质的方法，所述方法包括将生物质与根据本文公开的方法生产的酶组合物接触。本文描述了本教导内容的各个特征。V、各种实施方案的描述可以理解，前述一般性描述和下列详细的描述都只是示例和解释性的，不限于本文描述的组合物和方法。除非本文中另外定义，则本文使用的所有技术和科技术语都具有本发明所属领域的普通技术人员一般理解的相同含义。在本申请中，除非另外说明，单数的使用包括了复数。除非另外说明，“或”的使用意指“和/或”。同时，术语“包括”和“包含” 及其各种语态并非意在限制。本文所指的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有氨基酸和核苷酸序列，都通过引用明确整合到本文中。本文提供的小标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，可通过整体参考说明书产生。因此，通过整体参考说明书可以更全面的定义本文中的术语。A.定义如本文中使用的，除非另外指出，否则应使用下列定义。如本文中使用的，术语“木聚糖酶”指源自微生物(例如真菌、细菌)或植物或动物的蛋白质或蛋白质的多肽结构域或多肽，并具有催化木聚糖切割的能力，所述木聚糖包括在木聚糖的碳水化合物骨架的一个或多个各种位置上分支的木聚糖和木寡糖 (xylooligosaccharide)。优选的，对于本公开内容，木聚糖酶是内切_1，4_β-木聚糖酶(Ε. C. 3. 2. 1. 8)。在一些实施方案中，木聚糖酶是0-木糖苷酶或木聚糖1，4_0-木糖苷酶或1，4-β-D-木聚糖木糖水解酶(xylohydrolase)或木二糖酶(xylobiase)或外切 1，4-β-木糖苷酶(EC 3.2. 1.37)，包括从木聚糖聚合物的非还原端水解连续的D-木糖残基的酶。已鉴别和表征了来自真菌和细菌微生物的多种木聚糖酶(参见例如美国专利 5, 437, 992 ；Coughlin, M. P.见上文；Biely，P.等人，Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases, Espoo 1993, P. Souminen 禾口 Τ· Reinikainen 编著，Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research8 :125-1 (1993))。特别的是，已在里氏木霉中鉴别了三种特定的木聚糖酶(XYN1、XYN2 和 XYN3) (Tenkanen 等人，Enzyme Microb. Technol. 14 :566(1992)； iTorronen 等人，Bio/technology 10:1461(1992);和 Xu 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 49 :718(1998))。Saloheimo 等人的名为“Xylanase from Trichoderma reesei,method for production thereof, and methods employing this enzyme (里氏木霉的木聚糖酶，其生产方法和使用该酶的方法)”的美国专利6，555，335和6，768，001中描述了从里氏木霉中分离的第四种木聚糖酶(XYN4)，其通过引用全文整合到本文中。在一些实施方案中，XYN2是包含这样的序列的多肽，所述序列与mvsftsllaaspps rascrpaaevesvavekrqtiqpgtgynngyfysywndghggvtytngpggqfsvnwsnsgnfvggkgwqpgtknkv infsgsynpngnsylsvygwsrnplieyyivenfgtynpstgatklgevtsdgsvydiyrtqrvnqpsiigtatfyq ywsvrrnhrssgsvntanhfnawaqqgltlgtmdyqivavegyfssgsasitvs(SEQ ID No :1) ^tJ 22 M 222 位的至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250或至少300 个连续的氨基酸残基具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100% 的序列同一性。XYN2的信号序列是加下划线的。编码序列可见于Τδιτδι^η等人，1992，Biotechnology 10 :1461-65 中。在一些实施方案中，XYN3是包含这样的序列的多肽，所述序列与mkanvilcllaplv aalptetihldpelaalranltertadlwdrqasqsidqlikrkgklyfgtatdrglIqreknaaiiqadlgqvtpe nsmkwqslennqgqlnwgdadylvnfaqqngksirghtIiwhsqlpawvnninnadtlrqvirthvstvvgrykgki rawdvvneifnedgtlrssvfsrllgeefvsiafraardadpsarlyindynldranygkvnglktyvskwisqgvp idgigsqshlsggggsgtlgalqqlatvpvtelaiteldiqgapttdytqvvqaclsvskcvgitvwgisdkdswra stnpllfdanfnpkpaynsivgiIq(SEQ ID NO :2)的 17 至 347 位的至少 50、至少 75、至少 100、 至少125、至少150、至少175、至少200、至少250或至少300个连续的氨基酸残基具有至少 85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。SEQ ID NO :2是未成熟的XYN3的序列。Xyn3具有预测的信号序列，对应SEQ ID NO :2的1至16位(加下划线)；切割信号序列预计将产生具有对应于SEQ ID NO :2的17至347位的序列的成熟蛋白质。如本文中使用的，“寡糖”指含有少数(通常是3至10个)组分糖(单糖)的糖类聚合物。单糖的实例包括但不限于葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和核糖。 如本文中使用的，“二糖”指由两个单体组成的糖。“葡萄糖”是纤维素中最常见的糖。如本文中使用的，术语“葡萄糖溶液”指包含单糖葡萄糖、含有至少一个葡萄糖单位的二糖或短的寡聚物(即，具有3至4个糖)的溶液。葡萄糖溶液中可包括的示例性寡聚物包括但不限于纤维二糖(由通过β (1 — 4)键连接的两个葡萄糖分子组成的二糖)和乳糖(由通过β (1 — 4)键连接的β -D-半乳糖和β -D-葡萄糖组成的二糖)。如本文中使用的，术语“戊糖”包括含有至少一个戊糖的粗制的、未精制或未纯化的组合物。示例性的粗制戊糖组合物包括但不限于木糖醇设备、成浆设备、造纸植物或其它生物精炼的黑液。“纤维素酶”、“纤维素水解酶”或“纤维素酶”意指细菌或真菌的外切葡聚糖酶或外切纤维二糖水解酶，和/或内切葡聚糖酶，和/或葡糖苷酶。这三种不同类型的纤维素酶协同作用，将纤维素及其衍生物转化为葡萄糖。如本文中使用的，术语“转糖基化酶”指作为将单糖单位从非活化糖转移至受体分子上的催化剂发挥作用的细菌或真菌的酶，所述非活化糖例如蔗糖、乳糖或淀粉，所述受体分子包括但不限于水和其它的糖单位。糖基转移的结果可以是单糖、寡糖或多糖。经典的糖基转移酶分类在EC 2. 4中。葡聚糖蔗糖酶(EC 2. 4. 1. 5)和环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(EC 2.4. 1. 19)是能够转移葡萄糖单位的代表性的经典糖基转移酶。其它一些分类在 EC3. 2中的酶，当存在过量的单糖时，可以催化单糖单位向受体分子(通常是另一种糖)的转移。过量时，由糖苷酶(EC 3. 2)活性的典型产物——单糖的高浓度存在，逆向驱动糖苷酶反应，导致添加而非去除单糖单位。可作为转糖基化酶发挥功能的示例性糖苷酶包括但不限于β -葡糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)、内切葡聚糖酶(例如，EC 3. 2. 1. 71)、β -木糖苷酶(EC 3. 2. 1. 27)和木葡聚糖酶(3. 2. 1. 151)。“丝状真菌“包括真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(Oomycota)的所有丝状形式。在一些实施方案中，全培养液是从支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、 金小孢子属(Chrysosporium)、裸孢壳属(Emericella)、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola) > ^βΜ (Mucor) > ^β M (Myceliophthora) >(Neurospora) >
柱霉属(Scytalidium)、羧孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属 (Trichoderma)的物种或源自它们的物种中制备的。“诱导物”是导致细胞比在它们缺少诱导物生产时生产更大量的酶或其它物质的任何化合物。如本文中使用的，术语“分离的”或“纯化的”指除掉其天然相关的至少一种组分的核酸或氨基酸。B.方法丝状真菌里氏木霉是一种最广泛研究的纤维素水解生物(综述例如Nevalainen 和Penttila，Mycota，303-319，1995的综述)。在工业中，出于多种目的使用木霉属的纤维素水解酶，包括生产燃料乙醇、纸、人造丝、玻璃纸、去垢剂和纤维。纤维素酶也被用于改善动物饲料的营养价值，和促进从植物细胞中提取有价值的组分(Mandels，Biochem. Soc. Trans.，414-16. 1985)。因此，这些酶对于多种有用产物的生产是重要的。纤维素酶和木聚糖酶在木霉中的生产取决于可利用的碳源。纤维素、乳糖和二糖槐糖诱导里氏木霉的纤维素酶合成。相反，葡萄糖的存在导致对纤维素酶基因表达的严格抑制。相似的，里氏木霉中的木聚糖酶也受严格的调控。与纤维素酶相似，至少一些木聚糖酶是受葡萄糖的严格抑制的。提供用于工业规模生产的合适诱导物是造成目前难以生产纤维素酶和半纤维素酶(特别是木聚糖酶)的平衡混合物的主要问题因素。现在发现，当在升高的温度下将转糖基化酶孵育在浓缩的葡萄糖溶液中，且之后补充木糖时，产生了能够诱导生产纤维素酶和木聚糖酶的混合的糖类组合物。所述混合的糖类组合物具有在约2至25g/L之间的槐糖，和在约2至25g/L之间的木糖。此外，所述混合的糖类组合物可以包括在约35至60g/L之间的龙胆二糖。令人惊讶的是，如本文所述制备的混合的糖类组合物不需要任何额外的纯化。所述组合物足以照原样诱导纤维素酶和木聚糖酶生产。该发现提供了目前工业使用的乳糖或纯化槐糖的廉价替代物，以及用于受丝状真菌中的诱导型启动子调控的蛋白质的生产的较固体纤维素更方便的替代物。此外，所表达的酶组合物含有比根据现有工业实践制备的纤维素酶混合物更大量的木聚糖酶活性。在生产混合的糖类组合物的替代方法中，可以向葡萄糖溶液(例如，20% )中添加终末发酵培养液(表达的纤维素水解酶和细胞)。细胞的存在不影响槐糖形成。因而，不需要使用纯化的或部分纯化的转糖基化酶。即使仍然存在完整的细胞和细胞碎片，也可以使用在发酵末期存在的酶混合物。在一个实施方案中，本教导内容提供了混合的糖类组合物，其包含加工的葡萄糖溶液和戊糖，例如木糖，可在丝状真菌中用于诱导一系列纤维素水解酶的生产，所述酶包括一种或多种选自以下的酶内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和木聚糖酶。在一个实施方案中，混合的糖类组合物诱导里氏木霉的纤维素酶和木聚糖酶生产。因为已知纤维素酶和木聚糖酶基因受存在的葡萄糖的抑制，故令人惊讶的是，所述溶液有效的同时诱导纤维素酶和木聚糖酶的基因表达。在一个实施方案中，通过制备5% -75% (wt/wt)葡萄糖的无菌溶液，制备诱导性补料(inducing feed)。向无菌的葡萄糖溶液中添加转糖基化酶。在一些实施方案中，转糖基化酶是葡糖苷酶。在一个方面，所添加的葡糖苷酶在酶-葡萄糖溶液中的终活性少于200IU/ml。在另一个方面，酶-葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性在1.5IU/ml和 200IU/ml之间。在混合的纤维素酶组合物中，转糖基化酶可以作为一种或多种组分存在。 通常，向无菌的葡萄糖溶液添加混合纤维素酶组合物至终浓度在2g至20g总蛋白质/L之间。最终蛋白质范围可低至0.5g/L，高至50g/L。在50°C-75°C孵育酶-葡萄糖溶液。在一些实施方案中，在约50°C至约65°C之间孵育酶-葡萄糖溶液。溶液混合孵育8小时至7 天。在一个实施方案中，孵育时期大于两天。在第二个实施方案中，孵育时期是两天。在第三个实施方案中，孵育时期是三天。收获加工的葡萄糖溶液，补充木糖并用于发酵补料。任选的，在添加过滤的无菌酶溶液之前，将加工的葡萄糖溶液灭菌。在更大的体积中，可以将组合的葡萄糖-酶溶液连续灭菌，例如，在通往孵育罐的途中通过热交换器在135°C下2分钟。可以在升高的温度下孵育之前或之后，向葡萄糖和酶中添加戊糖。另一方面提供了制备酶组合物的方法，包括(a)将葡萄糖溶液与转糖基化酶混合，产生酶-葡萄糖混合物；(b)在升高的温度下孵育酶-葡萄糖混合物一定时间，所述时间足以产生包含至少一种二糖或寡聚物的加工的葡萄糖混合物；(c)将加工的葡萄糖混合物与戊糖混合，产生混合的糖类组合物；和(d)在有益于蛋白质表达的条件下，将丝状真菌暴露于混合的糖类组合物中，产生酶组合物。优选的，所述酶组合物包含80%至98%的纤维素酶和2%至20%木聚糖酶。在某些实施方案中，所述有益于蛋白质表达的条件包括在约25°C和约30°C之间的温度。在其他实施方案中，所述有益于蛋白质表达的条件包括酸性条件，更特别的是在约4. 0和约6. 0之间的pH。用于生产纤维素水解酶的发酵方法本身是本领域已知的。例如，可以通过固体或浸没培养物生产纤维素酶，包括分批式、补料分批式和连续流动式的过程。在包含含水矿物盐培养基、有机生长因子、碳源和能源材料、分子氧，以及当然，一种或多种待使用的特定微生物物种的起始接种物的生长培养基中实现培养。除碳源和能源、氧、可同化的氮以及微生物的接种物以外，还必须以恰当比例提供合适量的矿物营养物，保证恰当的微生物生长，使微生物转化过程中的细胞对碳源和能源的同化作用最大化，并以发酵培养基中的最大的细胞密度实现最大的细胞产量。如本领域已知的，含水的矿物培养基的组成可以广泛改变，部分取决于所使用的微生物和底物。除氮外，矿物培养基应该包括合适量的磷、镁、钙、钾、硫和钠，它们以合适的可溶性可同化型离子和结合的形式，还应优选的存在某些痕量元素，例如铜、锰、钼、锌、铁、 硼和碘，及其他，仍然以合适的可溶性可同化的形式，上述均是本领域已知的。发酵反应是好氧的过程，其中通过含分子氧的气体(例如空气、富氧空气或者甚至纯的分子氧)来供应所需的分子氧，以供维持发酵容器的内容物合适的氧分压，有效帮助微生物以兴旺的方式生长。有效地，通过使用加氧的烃底物，降低了微生物生长的氧需求。然而，必须提供分子氧供生长，因为微生物的底物同化和相应生长部分是氧化的过程。虽然通气速率可以在大范围内改变，但通气一般在约0. 5至10，优选约0. 5至 7 (在所使用的压力和25°C下的)含氧气体的体积/发酵罐中的液体体积/分钟的范围内的速率下进行。所述量是基于向反应器供应的正常氧含量的空气的，按纯氧计，各自的范围将是约0. 1至1. 7，或优选约0. 1至1. 3 (在所使用的压力和25°C下的)氧气体积/发酵罐中的液体体积/分钟。用于微生物转化过程的压力可以广泛变化。由于可实现仪器和操作成本对氧溶解度的平衡，压力一般在约0至50psig的范围内，目前优选是约0至30psig，更优选至少略微超过大气压。大于大气压是有利的，因为此类压力倾向于增加含水发酵物中的溶解氧浓度， 这反过来可以帮助增加细胞生长速率。与此同时，这被下述事实所平衡，即高的大气压增加仪器和操作成本。可以一定程度的改变发酵温度，但对于丝状真菌例如里氏木霉而言，温度一般在约20°C至约40°C的范围内，一般优选在约25°C至34°C的范围内，取决于所选择的微生物菌株。微生物还需要可同化的氮源。可同化的氮源可以是任何的含氮化合物或能够以适合微生物代谢利用的方式释放氮的化合物。同时可以使用多种有机氮源化合物，例如蛋白质水解物，一般可利用便宜的含氮化合物，例如氨、氢氧化铵、尿素和各种铵盐，如磷酸铵、 硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵，或各种其他的铵化合物。氨气本身是便于大规模操作的，可以通过合适量的含水发酵物(发酵培养基)鼓泡使用。与此同时，此类氨还可以用于帮助控制 pH。含水的微生物发酵物(发酵混合物)的pH范围应该在约2. 0至8. 0的示例性范围内。对于丝状真菌，pH通常在约2. 5至8. 0的范围内；对于里氏木霉，pH通常在约3. 0至 7. 0的范围内。某些微生物的pH范围偏好一定程度上取决于所使用的培养基，以及特定的微生物，因而本领域技术人员可以方便的随着培养基改变而确定一定的改变。在表达根据本公开内容的酶组合物的方法中，PH优选在约4. 0和约6. 0之间。尽管发酵混合物在发酵罐中的平均停留时间可以大幅改变，部分取决于所使用的发酵温度和培养物，但是其一般在约M至500小时的范围内，目前优选在约M至400小时。优选的，以这样的方式进行发酵，即可以将含碳底物控制为限制因子，从而为细胞提供良好的含碳底物的转化，并且避免细胞被大量未转化底物污染。后者对于水溶性底物不是问题，因为任何剩余的痕量物质都易于洗去。然而，在非水溶性底物的情况下这将是问题，需要增加产物处理步骤，例如合适的洗涤步骤。如上所述，达到该水平的时间不是关键的，可随特定的微生物和进行的发酵过程而变化。然而，本领域普遍已知如何确定发酵培养基中的碳源浓度，以及是否达到了理想的碳源水平。虽然可以以分批的或连续的操作来进行发酵，但是对于易于控制、生产均一量的产物和最经济的使用所有仪器而言，补料分批的操作是更优选的。如果需要，可以在向发酵罐中补料含水的矿物培养基之前，向所述含水的矿物培养基中添加部分或所有的碳源和能源材料和/或部分的可同化氮源(例如氨)。每种导入反应器的气流都优选的控制在预定的速率，或者响应通过监控如碳底物和能量底物的浓度、pH、溶解氧、发酵罐废气中的氧或二氧化碳、可通过透光率测量的细胞密度等可确定的需求。为了获得相对于底物装料尽可能高的微生物细胞产量，可以改变各种材料的补料速率，从而获得尽可能快速的，与碳源和能源的有效利用一致的细胞生长速率。在分批式，或者优选的补料分批式操作中，所有的仪器、反应器或发酵方式、器皿或容器、管道、附属的循环或冷却装置等都是初始灭菌的，通常通过使用蒸汽，例如在约 121°C至少约15分钟。然后，在存在所有所需营养物的条件下，用选定的微生物的培养物接
10种灭菌的反应器，所述营养物包括氧和含碳底物。所使用的发酵罐类型不是关键的，但是目前优选的是在 15L Biolafitte (Saint-Germain-en-Laye, France)中操作。还可以通过本领域中本身已知的程序来收集和纯化来自发酵培养液的纤维素酶和木聚糖酶。发酵培养液一般含有细胞残片，包括细胞、各种悬浮的固体和其他生物质污染物，以及所需的纤维素酶和木聚糖酶产物，后者优选的通过本领域已知的方式从发酵培养液中移出。用于此类移出的合适的方法包括常规的固液分离技术，例如离心、过滤、透析、微量过滤、旋转真空过滤或者其他已知的方法，来生产无细胞滤液。在使用例如超滤、蒸发或沉淀的技术结晶前，进一步浓缩发酵培养液或无细胞滤液是优选的。沉淀上清液或滤液的蛋白质组分可以通过盐的方式来实现，例如硫酸铵，再通过各种层析方法进行纯化，例如离子交换层析、亲和层析或相似领域已知的方法。各种丝状真菌的物种可用作表达宿主。在一些实施方案中，混合的糖类组合物用 Ti^/AMifeffiβ (Aspergillus aculeatus)(Aspergillus awamori) (Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)生产纤维素酶和木聚糖酶。在另一个方面，酶组合物是从杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides), Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀键抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗键抱(Fusarium graminearum)、禾赤键抱(Fusarium graminum)、异抱键抱(Fusarium heterosporum)、合欢木键抱(Fusarium negundi)、尖键抱(Fusarium oxysporum)、 多枝镰？包(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢 (Fusarium sambucinum)、肤色键抱(Fusarium sarcochroum)、拟分枝抱键抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色键抱(Fusarium sulphureum)、 (Fusarium torulosum)、类 (拟)丝抱键抱(Fusarium trichothecioides)或 Fusarium venenatum 制备的。在另一个方面，酶组合物是从特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、嗜热柱霉(Scytalidium thermophilum)或太瑞其Jf 梭孢壳霉(Thielavia terrestris)制备的。在另一个方面，酶组合物是从哈茨木霉 (Trichoderma harzianum) > ^^7^ (Trichoderma koningii)、^枝7^ (Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei),例如 RL-P37 (Sheir-Neiss 等人， Appl.Microbiol. Biotechnology,20(1984)，第 46-53 页；Montenecourt B. S.，Can.，1-20, 1987)、QM9414(ATCC No. 26921) ,NRRL 15709,ATCC 13631、56764、56466、56767 或绿色木霉 (Trichoderma viride)例如 ATCC 32098 和 32086 制备的。适用于本文所述方法的丝状真菌包括但不限于下列属曲霉属、支顶孢属、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢霉属(C 印 halosporium)、拟赌菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomium)、拟青霉属(paecilomyces)、金小孢子属、麦角菌属(Clavic印s)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、(Endothia mucor)、镰孢属、Gilocladium、 腐质霉属、Magnaporthe、毁丝霉属、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉属、脉孢菌属、平革菌属(Phanerochaete) > ^ lif M (Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、梨孢霉属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂裙菌属(Schizophylum)、 Stagonospora、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属、嗜热菌属(Thermomyces)、嗜热子囊菌属 (Thermoascus)、羧抱壳属、弯颈霉属、毛藓菌属(Trichophyton)禾口 Trametes pleurotus。 在一些实施方案中，丝状真菌包括但不限于以下的构巢曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、棘孢曲霉、A. kawachi 例如 NRRL 3112、ATCC 22342 (NRRL 3112)、ATCC 44733、ATCC 14331 和菌株UVK 143f、米曲霉例如ATCC 11490、粗糙脉孢菌、里氏木霉例如NRRL 15709,ATCC1363U 56764、56765、56466、56767、和绿色木霉例如ATCC 32098和32086。在优选的实施方案中， 丝状真菌是木霉属物种。用于公开方法的特别优选的种和菌株是里氏木霉RutC30，可以以里氏木霉ATCC 56765获得自美国典型培养物保藏中心。在优选的实施方案中，微生物宿主是物种木霉属、腐质霉属、镰孢属、曲霉属、链霉菌属(Str印tomyces)、嗜热单胞菌属(Thermomonospora)、芽孢杆菌属(Bacillus)或纤维单胞菌属(Cellulomonas)中的一员。另一个方面提供了制备酶组合物的方法，包括(a)将葡萄糖溶液与转糖基化酶混合，产生酶-葡萄糖混合物；(b)在升高的温度下孵育酶-葡萄糖混合物一定时间，所述时间足以产生包含至少一种二糖或寡聚物的加工的葡萄糖混合物；(c)将加工的葡萄糖混合物与戊糖混合，产生混合的糖类组合物；和(d)在有益于蛋白质表达的条件下，将丝状真菌暴露在混合的糖类组合物中，产生酶组合物，其中所述酶组合物包括相比没有步骤c)所制备的酶组合物增加至少1. 5倍的木聚糖酶。在一些实施方案中，所述酶组合物包括相比没有步骤C)所制备的酶组合物增加至少 1. 5 倍、2. O 倍、2. 5 倍、3. O 倍、3. 5 倍、4. O 倍、4. 5 倍、5. O 倍、5. 5 倍、6. O 倍、6. 5 倍、7. O 倍、7. 5 倍、8. O 倍、8. 5 倍、9. O 倍、9. 5 倍、10. O 倍、10. 5 倍、11. O 倍、11. 5 倍、12. O 倍、12. 5 倍、13. O倍、13. 5倍、14. O倍、14. 5倍、15. O倍的木聚糖酶。在一些实施方案中，所述酶组合物包括比例为约0.05、0. 10,0. 15、0. 20、0. 25、
0.30、0· 35、0· 40、0· 45、0· 50、0· 55、0· 60、0· 65、0· 70、0· 75、0· 80、0· 85、0· 90、0· 95、1· 00、
1.05,1. 10,1. 15,1. 20,1. 25,1. 30,1. 35,1. 40,1. 45,1. 50 的木聚糖酶比 CBHl (w/w)。在一些实施方案中，所述酶组合物包括比例为约0. 05,0. 10,0. 15,0. 20,0. 25,0. 30,0. 35,0. 40、
0.45,0. 50,0. 55,0. 60,0. 65,0. 70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90,0. 95,1. 00,1. 05,1. 10,1. 15、
1.20、1. 25、1. 30、1. 35、1. 40、1. 45、1. 50 的 XYN2 比 CBHl (w/w)。在一些实施方案中，所述酶组合物包括比例为约 0. 05,0. 10,0. 15,0. 20,0. 25,0. 30,0. 35,0. 40,0. 45,0. 50,0. 55、
0.60,0. 65,0. 70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90,0. 95,1. 00,1. 05,1. 10,1. 15,1. 20,1. 25,1. 30、
1.35、1. 40、1. 45、1. 50 的 XYN3 比 CBHl (w/w)。在一些实施方案中，所述酶组合物包括比例为约0. 5,0. 50,0. 55,0. 60,0. 65、
0.70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90,0. 95,1. 00,1. 05,1. 10,1. 15,1. 20,1. 25,1. 30,1. 35,1. 40、
1.45,1. 50的木聚糖酶比纤维素酶(w/w)。在一些实施方案中，所述酶组合物包括比例为约 0. 5,0. 50,0. 55,0. 60,0. 65,0. 70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90,0. 95,1. 00,1. 05,1. 10,1. 15、 1. 20,1. 25,1. 30,1. 35,1. 40,1. 45,1. 50 的木聚糖酶比 CBHU CBH2 和 BGLl0在另一个方面，本文提供了酶组合物，包括以下物质、由以下物质制备，或可通过混合以下物质获得(a) —种或多种的木聚糖酶，其中至少一种所述一种或多种的木聚糖酶是Xyn2或Xyn3 ；和(b) —种或多种的纤维素酶，其中至少一种所述一种或多种的纤维素酶是CBH1、CBH2或BGLl ；其中所述酶组合物包括比例为约0. 5至约1. 0的木聚糖酶比纤维素酶(w/w)，或比例为约0. 05至约1. 5的木聚糖酶比CBHl (w/w)。在一些实施方案中，酶组合物包括比例为约0. 1至约1. 0的XYN2比CBHl (w/w)。在一些实施方案中，酶组合物包括比例为约0. 05至约0. 5的XYN3比CBHl (w/w)。在另一个实施方案中，酶组合物包括比例为约0. 05至约1. 5的木聚糖酶比CBHl (w/w)。所述教导内容的另一个方面提供了降解生物质底物的方法，包括将所述生物质与通过本公开内容的混合糖类组合物诱导的酶组合物接触。在本公开内容的方法中，生物质底物可以是任何同时含有纤维素和半纤维素的生物质材料。在一些实施方案中，生物质底物包括但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆和造纸残余物。用于本文所述方法的生物质底物的普通形式包括但不限于树、灌木和草本、小麦、麦秸(wheat straw)、蔗渣、玉米、玉米壳、玉米籽粒包括籽粒纤维、谷物(如玉米)研磨的产品和副产品(包括湿磨法和干磨法)以及城市固体废物、废纸和庭院废物。生物质底物可获得自“原始生物质(virgin biomaSS)”(例如树、灌木、草本、果实、花、草本作物、硬木和软木)、“非原始生物质”(例如农业副产品、工业有机废物、建筑业和拆迁剩余物、城市固体废物和庭院废物)，或者“掺合生物质(blended biomass) ”，这是原始和非原始生物质的混合物。在一些实施方案中，生物质底物包括木本、木浆、造纸渣、纸浆废液、颗粒板 (particle board)、玉米秸秆、玉米纤维、稻、纸和纸浆加工废物、木本或草本植物、果浆、 植物浆、浮石(pumice)、酒糟(distiller grain)、草、稻壳、蔗渣、棉花、黄麻(jute)、大麻 (hemp)、亚麻(flax)、竹、剑麻(sisal)、马尼拉麻(abaca)、秆(straw)、玉米轴(corn cob)、 酒糟、叶、麦秸、椰毛、藻类、柳枝稷，及其混合物。生物质底物可直接使用，或用本领域已知的常规方法进行预处理。此类预处理包括化学的、物理的和生物学的预处理。例如，物理预处理技术可包括但不限于各种类型的研磨、压碎、气蒸/蒸汽喷发、辐射和温湿分解(hydrothermolysis)。化学预处理技术可以包括但不限于稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳和PH控制的温湿分解。生物学预处理技术可以包括但不限于应用溶解木质素的微生物。酶组合物的优化剂量水平根据所使用的生物质底物和预处理技术而改变。操作条件例如PH、温度和反应时间也可能影响生物质降解的速率。优选的，反应组合物含有0. 1 至200mg酶组合物/克生物质底物，更优选的，1至IOOmg酶组合物/克生物质底物，最优选的，3至25mg酶组合物/克生物质底物。示例性的量是0. 1-50、1-40、20-40、1-30、2-40 和10-20mg酶组合物/克生物质。可选的，可以基于系统中底物的量来确定酶量。在此情况下，反应组合物优选含有0. 1至50mg酶组合物/克总糖，更优选的，1至30mg酶组合物/ 克总糖，更优选的，5至20mg酶组合物/克总糖。可选的，可以基于系统中纤维素底物的量来确定酶量。在此情况下，反应组合物优选含有0. 2至IOOmg酶组合物/克总葡聚糖，更优选的，2至60mg酶组合物/克总葡聚糖，更优选的，10至40mg酶组合物/克总葡聚糖。相似的，可以通过底物生物质中的木聚糖的量来确定所利用的酶组合物的量。因此，反应组合物优选含有0. 2至IOOmg酶组合物/克木聚糖，更优选的，2至60mg酶组合物/克木聚糖， 更优选的，10至40mg酶组合物/克木聚糖。本公开内容的一个方面提供了这样的酶组合物，其同时具有大量的纤维素酶和木聚糖酶，并且是根据本文所述的方法生产的。在优选的实施方案中，酶组合物包括在总蛋白质的80%至98%范围内的纤维素酶和总蛋白质的2%至20%的范围内的木聚糖酶。在一个实施方案中，木聚糖酶代表大于2%的总蛋白质，优选大于约5%的总蛋白质，最优选大于约20%的总蛋白质。在另一个实施方案中，纤维素酶代表大于50%的总蛋白质，更优选大于约75%的总蛋白质，最优选大于约80%的总蛋白质。根据下列实施例可以进一步理解组合物和方法的其他方面和实施方案，但其不应被视为限制。对本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本教导内容的范围内进行材料和方法的许多修饰。
实施例A.实施例1 牛产混合的糖类组合物将71% (w/w)的葡萄糖溶液添加到空的发酵罐中。向葡萄糖溶液中添加过表达 β-葡糖苷酶(Accellerase BG, Danisco)的纤维素酶制品至终浓度为0. 0357MU β-glu活性/Kg葡萄糖糖浆。将含有葡萄糖和纤维素酶混合物的罐保持在65°C和pH 5.0下3天，轻柔混合。在孵育后，在121°C将溶液灭菌30分钟，收获至恰当的容器中进行发酵补料。发现所获得的加工的葡萄糖溶液的葡萄糖浓度从740g/Kg减少至570g/Kg。向该加工的葡萄糖溶液中的数批次中加入木糖，至15g/L的浓度，产生混合的糖类组合物。B.实施例2 牛产酶组合物用1. 5mL里氏木霉冰冻孢子悬浮液接种0. 8L培养基作为种子摇瓶。将该摇瓶分为2份0. 4L部分，并在48小时后，转移至2个不同的15LBiolafitte发酵罐中的&7L发酵培养基中。生长培养基具有下列组成(表1)表 1
培养基组分g/LKH2PO44(NH4)2S046.35MgS04-7H202CaCl2-2H200.53葡萄糖80Corn Steep Solids6.25(Roquette)痕量元素*1 ml/L痕量元素* :5g/L FeS04-7H20 ；1. 6g/L MnSO4-H2O ；1. 4g/LZnS04_7H20。在25或30°C，750rpm, 0. 3g糖补料/min和8标准升/分(SLM)气流下运行发酵罐。在从摇瓶接种至发酵罐后，将细胞在前18-M小时进行分批式生长。在分批的葡萄糖耗尽后，葡萄糖补料开始为0. 3g/分，并再持续180个小时。在该组发酵实验中，pH在4. 8和5. 5之间变动。温度在25和30°C之间变动，在一些情况下(表2中用“ + ”表示)，向转糖基化的葡萄糖溶液中添加15g/L木糖。表 2
1权利要求
1.制备混合的糖类组合物的方法，所述方法包括a)将葡萄糖溶液与转糖基化酶混合，产生酶-葡萄糖混合物；b)在升高的温度下孵育酶-葡萄糖混合物一定时间，所述时间足以产生包含至少一种寡糖的加工的葡萄糖混合物；c)将加工的葡萄糖混合物与戊糖混合，产生混合的糖类组合物。
2.权利要求1的方法，其中葡萄糖溶液包含从约5%至约75%(wt/wt)的葡萄糖。
3.权利要求1的方法，其中转糖基化酶是葡糖苷酶。
4.权利要求3的方法，其中酶-葡萄糖混合物含有每千克从约0.OlMU β -葡糖苷酶活性至约0. IMU β -葡糖苷酶活性。
5.权利要求1的方法，其中转糖基化酶是内切葡聚糖酶。
6.权利要求1的方法，其中升高的温度是从约50°C至约75°C。
7.权利要求1的方法，其中孵育纤维素酶-葡萄糖混合物8小时至500小时。
8.权利要求1的方法，其中戊糖是木糖。
9.权利要求1的方法，其中混合的糖类组合物中的木糖浓度是从约lg/L至约50g/L。
10.制备酶组合物的方法，其包括a)将葡萄糖溶液与转糖基化酶混合，产生酶-葡萄糖混合物；b)在升高的温度下孵育酶-葡萄糖混合物一定时间，所述时间足以产生包含至少一种寡糖的加工的葡萄糖混合物；c)将加工的葡萄糖混合物与戊糖混合，产生混合的糖类组合物；d)在有益于蛋白质表达的条件下，将丝状真菌暴露于混合的糖类组合物，产生酶组合物。
11.权利要求10的方法，其中酶组合物包含70%至98 %的纤维素酶和2 %至30 %的木聚糖酶。
12.权利要求10的方法，其中有益于蛋白质表达的条件包括在约25°C和约30°C之间的温度。
13.权利要求10的方法，其中有益于蛋白质表达的条件包括酸性条件。
14.权利要求13的方法，其中酸性条件包括在约4.0和约6. 0之间的pH。
15.权利要求10的方法，其中所述酶组合物包括相比没有步骤c)所制备的酶组合物增加至少1. 5倍的木聚糖酶。
16.权利要求10的方法，其中所述酶组合物包括相比没有步骤c)所制备的酶组合物增加至少1. 5倍的XYN2。
17.权利要求10的方法，其中所述酶组合物包括相比没有步骤c)所制备的酶组合物增加至少1. 5倍的XYN3。
18.权利要求10的方法，其中所述酶组合物包括比例为约0.05至约1. 5的木聚糖酶比 CBHl(w/w)。
19.权利要求10的方法，其中所述酶组合物包括比例为约0.1至约1. 0的XYN2比 CBHl(w/w)。
20.权利要求10的方法，其中所述酶组合物包括比例为约0.05至约0. 5的XYN3比 CBHl(w/w)。
21.权利要求10的方法，其中所述酶组合物包括比例为约0.05至约1. 5的木聚糖酶比 CBHl(w/w)。
22.权利要求10的方法，其中所述酶组合物包括比例为约0.5至约1. 0的木聚糖酶比纤维素酶(w/w)。
23.权利要求22的方法，其中所述木聚糖酶包括XYN2和XYN3。
24.权利要求22的方法，其中所述纤维素酶包括CBH1、CBH2和BGLl。
25.根据权利要求1的方法生产的混合的糖类组合物。
26.根据权利要求10的方法生产的酶组合物。
27.降解生物质的方法，其包括将生物质底物与权利要求22的酶组合物接触。
28.酶组合物，其包括以下物质、由以下物质制备，或通过混合以下物质可获得(a)一种或多种的木聚糖酶，其中至少一种所述一种或多种的木聚糖酶是XYN2或 XYN3 ；禾口(b)一种或多种的纤维素酶，其中至少一种所述一种或多种的纤维素酶是CBH1、CBH2 或BGLl ；其中所述酶组合物包括比例为约0.5至约1.0的木聚糖酶比纤维素酶(w/w)，或比例为约0. 05至约1. 5的木聚糖酶比CBHl (w/w)。
29.权利要求观的酶组合物，其中所述酶组合物包括比例为约0.1至约1. 0的XYN2比 CBHl(w/w)。
30.权利要求28的酶组合物，其中所述酶组合物包括比例为约0.05至约0. 5的XYN3 比 CBHl(w/w)ο
31.权利要求28的酶组合物，其中所述酶组合物包括比例为约0.5至约1. 0的木聚糖酶比纤维素酶(w/w)。
32.权利要求28的酶组合物，其中所述木聚糖酶包括XYN2和XYN3。
33.权利要求28的酶组合物，其中所述纤维素酶包括CBH1、CBH2和BGLl。
全文摘要
本公开文本涉及改善的蛋白质从细胞培养物的生产的方法，特别涉及可优选的增加从处于木聚糖酶基因启动子序列控制下的基因生产的蛋白质表达的培养组分和条件。改善的方法可用于生产具有增强的木聚糖酶和半纤维素水解活性的酶组合物。
文档编号C12P19/14GK102421888SQ201080018758
公开日2012年4月18日 申请日期2010年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者A·凯利, C·刘, C·米奇森 申请人:丹尼斯科美国公司