专利名称：检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的组合物以及使用该组合物用多重实时pcr同 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可区别地检测结核性分枝杆菌复合群(M. tuberculosis complex)和分枝杆菌属(myccAacteria genus)的组合物以及使用该组合物通过实时多重聚合酶链式反应(RT PCR)同时分析结核性分枝杆菌(M. tuberculosis)和分枝杆菌属。更具体而言，本发明涉及一种检测结核性分枝杆菌和分枝杆菌属的组合物，其包含(i)靶向结核性分枝杆菌特异性基因(IS6110)的引物和/或探针；和(ii)靶向分枝杆菌属特异性基因(内部转录间隔区(ITS))的引物和/或探针；和非必需地，(iii)靶向作为内对照的源自植物的基因的引物和/或探针。
背景技术：
结核病是一种在人类历史中呈现出最高死亡率的传染病，其是由0. 2 0. 5 μ m 厚、1 4 μ m长且杆状的分枝杆菌属菌株引起的。分枝杆菌属包括感染人和许多种动物并导致如结核病的呼吸系统疾病和如麻风病的疾病的各种分枝杆菌菌株，并且迄今已知大约100个物种(Shirmick TM等人， Mycobacterial taxonomy. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect Dis. 1994 ；13(11) :884-901)。尽管已知结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)为引起人患结核病的最重要的分枝杆菌，但是有结核分枝杆菌、很少出现的牛分枝杆菌(mycobacterium bovis) 等。已知麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)引起麻风病(Shinnick, Τ. M.禾口 Good, R. C. Mycobacterial taxonomy. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994 ； 13 (11) 884-901)。在不发达国家中结核病是一种流行的疾病，在韩国，每年遇到120，000例结核分枝杆菌新增病例，2003年报道和计数的新结核病感染为30，687例(相当于每十万人64 例)，并且在30个OECD成员国中，韩国的结核病死亡数目耻辱地位居首位(2004年国家统计局(National Statistical Office)的统计数据)。近来，获得性免疫缺陷综合征(AIDQ患者和其他免疫缺陷综合征患者、具有较弱免疫系统的婴儿等正在遭受非结核性分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria (NTM))的感染，而且表现出与结核性分枝杆菌感染相关症状相似的临床症状的非典型性结核病患者正在增加。NTM的实例包括多种非结核性分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria), 如鸟分枝杆菌(mycobacterium avium)(胞内鸟分枝杆菌(M. avium-intracellulare) 或鸟分枝杆菌复合群(M. avium complex))、偶发分枝杆菌(M. fortuitum)、龟分枝杆菌 (M. chelonae)、戈登氏分枝杆菌(M. gordonae)、斯氏分枝杆菌(M. szulagai)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)、日内瓦分枝杆菌(M. genavense) (Barnes, P. F.等人，Tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection. N. Engl. J. Med.1991 ；324(23) :1644-1650)。这些NTM中的许多种类表现出对结核性分枝杆菌药物的多药耐药性并且难以治疗(Kam, K. M.等人，Trends in Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis in Relation to Sputum Smear Positivity in Hong Kong, 1989-1999. Clin. Infect. Dis. 2002 ；34(3) :324-329)。已知NTM中最常见的鸟分枝杆菌复合群(MAC)对原发性结核药物表现出比结核性分枝杆菌低10 100倍的效能，并且美国胸科学会(American Thoracic Society(ATS)) 提出了关于由各种非结核性分枝杆菌菌种引起的疾病的诊断和治疗的指导方针(American Thoracic Society, Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 1997 ；156 (2) :S1_S25)。因此，非结核性分枝杆菌具有与结核性分枝杆菌非常相似的症状，但是就治疗药物而言它们可不同于结核性分枝杆菌。为了分别适宜地治疗结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌，需要准确地区分结核性分枝杆菌与非结核性分枝杆菌并且对其早期检测和诊断。诊断结核病的一般方法包括患者的临床症状测试、结核菌素皮肤反应测试、X射线显像、结核性分枝杆菌测试等。结核菌素测试是最容易的方法，简单易行，但是在由严重的结核病、麻疹和免疫抑制引起的无反应性的情况下常常表现假阴性。大约25%的X射线显像会根据检测者的能力而有所不同，因此使用X射线显像的诊断取决于检测者发现异常阴影的能力和检测者准确地判断该异常阴影的能力。结核性分枝杆菌检测是最准确的诊断结核病的方法并且包括涂片测试、培养测试、分子诊断测试等。涂片测试主要使用染色法，其中通过Ziehl-Neelsen染色确定耐酸性。此方法确保简单和快速地获得结果，但是不能区分结核性分枝杆菌与非结核性分枝杆菌，而且具有低灵敏性。培养测试在一定程度上具有高灵敏性，即，即使在Iml样品中只有大约10个细菌存在也可检出细菌，并且培养测试能够分离和准确诊断结核性分枝杆菌。此方法需要长的时间周期，例如，受过良好训练的研究人员进行培养和观察需要4 8周，因此对于治疗是不利、不适合的。BACTEC (Becton Dickinson, US)是一种新开发的培养方法，其中将杆菌接种到含有C14棕榈酸盐的液体培养基中，并且从使用放射性同位素计算的生长商数估计杆菌代谢产生的wCD2的量。此方法平均起来能够在16天之后获得结果，但是不利地是需要设备和专业人员来处理放射性同位素。聚合酶链式反应(PCR)接着电泳是一种在2 3小时内通过扩增特异性基因位点而快速和准确地确定结核性分枝杆菌存在的方法。此方法能够在一天内以95%以上的灵敏性和特异性从临床样品中检测结核性分枝杆菌，因此是有用的(Wilson，S. Μ.等人， Progress toward a simplified polymerase chain reaction and its application to diagnosis of tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 1993 ；31 (4) :776-78)。然而，此方法的不利之处在于，具有携带污染的高风险并且需要专业人员 (Noordhoek，G. Τ.等人，Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis :a blind comparison study among seven laboratories.J.Clin. Microbiol. 1994 ；32(2) :277-284)。同时，在结核病诊断中，PCR测试在涂片阳性样品中具有相当高的灵敏性和特异性，并且应当考虑，耐酸细菌涂片阳性和PCR阴性样品可被认为是被NTM感染的事实。NTM肺病高发的美国建议，当确定是否存在PCR抑制剂以及被试者再次测试为阴性时，耐酸细菌涂片阳性和PCR阳性被试者暂时地诊断为结核病，耐酸细菌涂片阳性和PCR 阴性被试者暂时地诊断为NTM。完成最终的NTM感染诊断花费4 8周的培养时间(疾病控制禾口予页防中心(Centers for Disease Control and Prevention (CDC)). Update :Nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR Morb. Mortal, ffkly. Rep. 2000 ；49 593-4)。近来，可以根据这些指导方针检测NTM感染，但是，如可能，NTM的直接检测将在临床上更有用。在韩国，结核病的发病率高而NTM疾病低发。因此，一般认为耐酸细菌涂片阳性被试者是感染了结核病，并且通常进行抗结核病药物治疗。然而，近来，在韩国，NTM和NTM 疾病的识别率提高了，NTM可以在免疫功能弱的那些人中引起疾病，不易诊断，由于高耐药性比例而难以治疗，并且具有高复发率(Scientific committee in Korean academy of tuberculosis and respiratory disease. National survey of mycobacterial diseases other than tuberculosis in Korea. Tuberc. Respir. Dis. 1995 ；42 :277-94.)。因此，日益需要可区别地诊断NTM的方法。最近的检测NTM的方法包括AFB染色，通常用于使用分子生物学方法(包括使用限制性内切酶的PCR-RFLP和使用特异性探针的PCR杂交)区分分枝杆菌种类的方法。所有这些方法的灵敏性都低，并且不利地需要在先培养或者牵涉复杂的实验步骤，因此不适合用于早期快速检测结核性分枝杆菌和分枝杆菌属。
发明内容
技术问题因此，本发明致力于解决上述问题和其他的仍然有待解决的技术问题。本发明的一个目的是提供一种对IS6110 (结核性分枝杆菌特异性基因位点)具有优异的灵敏性的引物和/或探针，从而准确地诊断结核性分枝杆菌。本发明的另一个目的是提供一种检测在分枝杆菌属中普遍存在的ITS基因的高度特异性基因位点并因此具有优异的灵敏性的引物和/或探针，从而确定分枝杆菌属(非结核性分枝杆菌)的存在。本发明的又一个目的是提供一种使用所述引物和/或探针通过实时多重聚合酶链式反应同时检测结核性分枝杆菌复合群和非结核性分枝杆菌的方法。技术方案1.检测结核件分枝杆菌或分枝杆菌属的引物本发明涉及一种可区别地检测结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的组合物，其包含含有No. 1碱基序列和kq. No. 2碱基序列中的一种或多种的引物；和含有kq. No. 3碱基序列 kq. No. 11碱基序列中的一种或多种的引物。优选地，本发明涉及一种可区别地检测结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的组合物，其包含含有No. 1碱基序列的引物和含有kq. No. 2碱基序列的引物；或者含有kq. No. 3碱基序列 kq. No. 9碱基序列中的一种或两种或更多种的引物和含有kq. No. 10碱基序列 kq. No. 11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物两者。更优选地，本发明涉及一种可区别地检测结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的组合物，其包含含有No. 1碱基序列的引物；含有kq. No. 3碱基序列 kq. No. 9碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；和含有No. 10碱基序列 kq. No. 11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物。本文所用术语“含有kq. No. χ碱基序列的引物”包括具有95%以上的序列相同性的碱基序列。例如，在引物是20bp的情况下，当20bp中的2或更多bp不同的情况下，解链温度的下降5度以上，因此得到不好的结果，而在其只有Ibp不同的情况下，当PCR过程中在稍微下降的退火温度下进行试验时，可以得到同一结果。在本说明书中，以下，为了更好地说明，“含有^^. No. χ碱基序列的引物”将简称为 "Seq. No. χ 引物”。在本说明书中，Seq. No. 1引物和Seq. No. 2引物是靶向IS6110基因位点(结核性分枝杆菌复合群特异性基因位点)的引物。通常，“结核性分枝杆菌”狭义地指结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)。本发明中，“结核性分枝杆菌”广义地指结核分枝杆菌以及牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌(mycobacterium microti)禾口非洲分枝杆菌(mycobacterium africanum)。在一些情况下，将其称为“结核性分枝杆菌复合群”或“TB复合群”。IS6110基因是在结核性分枝杆菌复合群(如结核分枝杆菌和牛分枝杆菌)中发现的插入序列。已知结核性分枝杆菌复合群包含10 12个拷贝的IS6110(IS6110广泛用于结核病的 PCR 诊断)(Thierry D.等人，J. Clin. Microbiol. 1990 ；28 (12) :2668-2673) 然而，据Kent等人报道，取决于引物位置的选择，IS6110表现出不同的假阳性风险比率 (J.Clin. Microbiol. 1995 ；33(9) :2290-2293)。因此，本发明的发明人通过碱基序列分析研究了具有低假阳性风险的位点。结果， 从下列实施例中可以看出，No. 1引物和kq. No. 2引物是只扩增结核性分枝杆菌复合群的IS6110基因并且在结核性分枝杆菌复合群的IS6110基因位点中表现出97%以上的相当高的灵敏性和99%以上的阳性预测率(这说明假阳性的风险非常低)的引物碱基序列。 这样表现出高灵敏性和阳性预测率的引物迄今还未发现过。因此，当使用kq. No. 1引物、Seq. No. 2引物或其组合时，可以高度可靠地检测结核性分枝杆菌复合群。为了确定非结核性分枝杆菌的存在与否，分枝杆菌的识别是重要的。关于这一点， 在分枝杆菌属中rpoB基因是共有的，因此众所周知，rpoB的存在可以用于识别分枝杆菌物种(Lee，Hye-Young，等人，韩国专利公开 No. 10-2001-0038701)。然而，该专利使用PCR-RFLP，因此问题在于，例如，由于低灵敏性而必需进行在先培养并且实验步骤复杂，因此不适合用于早期快速检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌
jM ο因此，为了解决这些问题，本发明人开发了一种新的特异性针对rpoB基因位点的引物，该引物形成适合用于实时PCR的IOObp以下的PCR扩增产物(Kang Jin kok等人， 韩国专利申请No. 2008-0090156)。
然而，rpoB是编码RNA聚合酶β亚单位的基因，并且从该申请的特异性测试结果可以看出，许多种微生物都没有表现出阳性，但是表现出与结核病相似的肺炎症状的诺卡氏菌属(Nocardia genus)微生物和与分枝杆菌属相似的红球菌属(rhodococcus genus) 表现出阳性，这是由于在一些微生物中存在执行共同功能的相似碱基序列。同时，为了确定非结核性分枝杆菌的存在，分枝杆菌属的识别是重要的。众所周知，ITS基因以及rpoB基因包含在分枝杆菌属中，因此用于识别细菌种类(Kim In Soo等人，韩国专利No. 0725579)。然而，该专利使用的引物为了用于PCR反向杂交而形成大小为约250 450bp的 PCR产物，因此不利地不适合用于快速检测的实时PCR。因此，本发明人开发了形成大小适合用于ITS位点的实时PCR的扩增产物的引物。 也就是说，Seq. No. 3 11引物是靶向ITS基因位点(分枝杆菌属特异性基因位点)的引物。这些引物形成大小为IOObp以下的PCR扩增产物。因此，这些引物有利地确保分枝杆菌属被相当可靠地且快速地检测并表现出比以往更高的特异性，这是因为它们不会与诺卡氏菌属微生物和红球菌属微生物反应。根据本发明的检测结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的组合物可以进一步有选择地包含内对照引物。该内对照用于确定是否发生了假阴性问题，也就是说，PCR反应正常进行。 无论样本中是否存在结核性分枝杆菌或分枝杆菌，可以随机地选择正常表达的基因。在优选的实施方式中，所述内对照引物可为加入到所有样本中的源自植物的基因特异性引物。该源自植物的基因优选为凝集素，并且凝集素基因特异性引物可为含有kq. No. 15碱基序列的引物或者含有kq. No. 16碱基序列的引物。在本发明中，在下表1中给出kq. No. 1 11引物、kq. No. 15引物和kq. No. 16 引物的碱基序列。[表1]引物的碱基序列
权利要求
1.一种可区别地检测结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的组合物，其包含含有kq. No. 1碱基序列和kq. No. 2碱基序列中的一种或多种的引物；和含有kq. No. 3碱基序列 kq. No. 11碱基序列中的一种或多种的引物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含含有No.1碱基序列的引物；和含有No. 2碱基序列的引物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含含有No.3碱基序列 Seq. No. 9碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；和含有kq. No. 10碱基序列 kq. No. 11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含含有kq. No. 1碱基序列的引物；含有kq. No. 2碱基序列的引物；含有kq. No. 3碱基序列 kq. No. 9碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；和含有kq. No. 10碱基序列 kq. No. 11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的组合物，其进一步包含内对照引物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述内对照引物是源自植物的基因特异性引物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述源自植物的基因是凝集素，并且所述源自植物的基因特异性引物包括含有No. 15碱基序列的引物和含有kq. No. 16碱基序列的引物中的一种或两种或更多种。
8.一种检测结核性分枝杆菌(M. tuberculosis)的组合物，其包含含有kq. No. 1碱基序列的正义引物和含有No. 2碱基序列的反义引物中的一种或两种或更多种，作为特异性针对结核性分枝杆菌的IS6110基因的引物。
9.一种检测分枝杆菌属的组合物，其包含含有kq. No. 3碱基序列 kq. No. 9碱基序列的正义引物中的一种或两种或更多种；含有No. 10碱基序列 kq. No. 11碱基序列的反义引物中的一种或两种或更多种引物；或其组合，作为特异性针对分枝杆菌属ITS 基因的引物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述特异性针对分枝杆菌属ITS基因的引物形成长度为IOObp以下的PCR扩增产物。
11.一种检测结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的组合物，其包含选自12碱基序列的探针、含有No. 13碱基序列的探针和含有kq. No. 14碱基序列的探针中的一种或两种或更多种。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述探针用荧光物质在其5’末端和3’末端标记，并且在5’末端标记的荧光物质(报道分子)和在3’末端标记的荧光物质(猝灭物)相互干扰。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述在5’末端标记的荧光物质选自6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、四氯-6-羧基荧光素和花青-5 (C0)中，而所述在3’末端标记的荧光物质为6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)或黑洞猝灭剂-1，2，3(BHQ-1， 2,3)。
14.一种使用实时PCR测定区分、检测和分析结核性分枝杆菌和分枝杆菌属的组合物，其包含含有kq. No. 1碱基序列和kq. No. 2碱基序列中的一种或两种或更多种的引物； 含有kq. No. 3碱基序列 kq. No. 11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；和含有kq. No. 12碱基序列 kq. No. 14碱基序列中的一种或两种或更多种的探针。
15.根据权利要求14所述的组合物，其进一步包含 内对照引物；和内对照探针。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述内对照引物为含有kq.No. 15碱基序列的正义引物或者含有No. 16碱基序列的反义引物，并且所述内对照探针为含有kq. No. 17碱基序列的探针。
17.根据权利要求14所述的组合物，其中，所述组合物包含(i)特异性针对结核性分枝杆菌IS6110基因的引物和探针混合物，其包含含有kq. No. 1碱基序列的正义引物和含有kq. No. 2碱基序列的反义引物；以及含有kq. No. 12碱基序列的探针；( )特异性针对分枝杆菌属ITS基因的引物和探针混合物，其包含含有kq. No. 3碱基序列 No. 9碱基序列的正义引物和含有kq. No. 10碱基序列 kq. No. 11碱基序列的反义引物；以及含有No. 13碱基序列的探针和/或含有kq. No. 14碱基序列的探针；(iii)特异性针对内对照基因的引物和探针混合物，其包含含有No.15碱基序列的正义引物和含有kq. No. 16碱基序列的反义引物；以及含有kq. No. 17碱基序列的探针； 禾口(iv)PCR反应混合物，其包含缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和无菌蒸馏水。
18.—种结核性分枝杆菌分析试剂盒，其包含根据权利要求17所述的用于分析的组合物。
19.一种使用根据权利要求17所述的组合物分析结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的方法，其包括(1)将用于分析的组合物与从样本中提取的细菌DNA混合以制备用于基因分析的样本；(2)使所述用于基因分析的样本进行实时PCR以得到PCR产物；(3)定量PCR产物以得到定量曲线；和(4)使用所述定量曲线定量在所述从样本中提取的细菌DNA中存在的IS6110特异性基因、ITS特异性基因和内对照特异性基因。
20.—种ITS基因特异性引物，其包含kq. No. 3碱基序列 kq. No. 11碱基序列中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种检测结核性分枝杆菌(M.tuberculosis)和分枝杆菌属的组合物，其包含(i)靶向结核性分枝杆菌特异性基因(IS6110)的引物和/或探针；和(ii)靶向分枝杆菌属特异性基因(内部转录间隔区(ITS))的引物和/或探针；和非必需地，(iii)靶向作为内对照的源自植物的基因的引物和/或探针。当使用所述组合物进行实时多重聚合酶链式反应时，可以通过单个反应检测非结核性分枝杆菌和分枝杆菌属，因此可以以高可靠性快速且容易地实现临床诊断。
文档编号C12N15/31GK102471806SQ201080036118
公开日2012年5月23日 申请日期2010年8月25日 优先权日2009年8月26日
发明者俞恩珠, 姜镇锡, 朴荣石 申请人:株式会社Lg生命科学