专利名称：一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法
技术领域：
本发明属于兽医生物学技术领域，涉及一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法。
背景技术：
猪肺炎支原体是引起猪的接触性慢性呼吸道疾病的重要病原之一，是全世界广泛存在严重危害养猪业健康发展的主要猪病病原之一，其主要危害是引起猪的生长受阻、饲料转化率大幅下降，继发引起其他疾病的发生并加重发病症状。猪支原体肺炎灭活疫苗可以减少喘气病的发生，但优质疫苗的前提需要有一种好的培养基来支撑。培养基是人工合成各种营养物质供微生物生长的基质。支原体是一种微小原核生物，无细胞壁，可在人工培养基上生长，形成小菌落，但培养条件要求十分苛刻，且生长速度慢，从而难以培养，这样对防治猪气喘病的研究造成困难。1964年Goodwin等首先使用煮沸猪肺组织的灭活细胞培养基成功进行猪肺炎支原体的分离培养。1965年Switer氏等和Goodwin等都各自成功地研究出了能形成菌落的固体培养基。1973年，我国上海农科院畜牧兽医研究所将猪肺炎支原体通过猪肺埋块细胞培养240余代的基础上，参考Goodwin等报导的复合培养基，使用了无细胞培养技术。1975 年江苏农业科学院在Switer的培养基的基础上作了一些改进，创造了 KM2培养基。2000年版兽医生物制品制造及检验规程中提出以脑心浸粉和PPLO肉汤为主要原料的猪肺炎支原体培养基。2006年农业行业标准中提出猪支原体肺炎的病原分离用似6培养基。但现有技术的共同缺点是，猪肺炎支原体在培养基中的生长速度较慢，同时活菌滴度在IO7 IO8CCU 左右，活菌滴度低，不够理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种营养成分丰富、渗透压适合猪肺炎支原体生长，且生长快、活菌滴度高的猪肺炎支原体培养基，按照该培养基培养的猪肺炎支原体生长速度快、 活菌滴度高，分离的敏感性强，可用于猪肺炎支原体生化特征、遗传、免疫等方面的研究。本发明另一目的是提供该猪肺炎支原体培养基的制备方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明的提供一种猪肺炎支原体培养基，该培养基主要由A液和B液和C液和/ 或琼脂组成；A液由脑心浸出液、PPLO肉汤、去离子水组成；B液由10XHank’S液、乳清蛋白水解物、酵母浸出液、丙酮酸钠、示蛋白胨、硫代硫酸钠、0. 酚红、青霉素、去离子水组成； C液为健康马血清。其中，上述成分的配比如下A液脑心浸出液2. 0 5. 0g、PPL0肉汤1. 5 5. 0g、 去离子水200 300ml ；B液10XHank，s液1. 0 5. 0ml、乳清蛋白水解物1. 0 3. 0g、 酵母浸出液3. 0 5. 0g、丙酮酸钠0. 8 2. 5g、示蛋白胨1. 0 3. 0g、硫代硫酸钠0. 1 0. 5g、0. 酚红10 20ml、青霉素200 400u/ml、去离子水500 600ml ；C液健康马血清 140 200ml ；琼脂 7. 0 10g。
进一步，上述成分的配比如下A液脑心浸出液4. 5g、PPLO肉汤4. 0g、去离子水260ml ；B液dOXHank，s液3. 0ml、乳清蛋白水解物1. 25g、酵母浸出液4. 5g、丙酮酸钠l.Og、示蛋白胨1.5g、硫代硫酸钠0. 135g、0. 酚红17ml、青霉素200u/ml、去离子水 560ml ；C液健康马血清160ml ；琼脂IOgo本发明 还提供了该猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于制备步骤如下①按配比称取A液各成分，将各成分混合，搅拌，使之完全溶解，116°C高压灭菌20 分钟，冷却后备用；②按配比称取B液各成分，将各成分混合，搅拌，使之完全溶解，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存备用；③按配比称取C液成分，将A液、B液和C液充分混合均勻，用lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7. 6 7. 8，即得猪肺炎支原体的液体培养基。进一步，该猪肺炎支原体培养基的制备方法中还可包括如下步骤按配比称取琼月旨，加入步骤③制得的培养基中，混合均勻，从而得到猪肺炎支原体的固体培养基。本发明的猪肺炎支原体培养基运用微生物学、有机、无机分析化学的技术原理，对不同的碳源、氮源、无机盐、蛋白质和胆固醇等诸多营养组分的组合进行了筛选，对培养基的PH值、渗透压、离子强度等进行了比较，研究出了适合猪肺炎支原体快速生长的培养基。 该培养基的配方中除基本成分外，在培养基中还添加了硫代硫酸钠、丙酮酸钠，上述成分的添加能明显提高猪肺炎支原体的的活菌滴度(CCU)；对猪肺炎支原体分离的敏感性强； 未添加前活菌滴度为lX107(XU/ml lX108(XU/ml，添加后活菌滴度为lX108(XU/ml 1 X IOkiCXUAiI ；活菌滴度和分离的敏感性均远远高于现有技术的培养基。通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施例方式实施例1本发明培养基的制备液体培养基A液脑心浸出液2. 0g、PPLO肉汤5. 0g、去离子水300ml以上各成分混合，搅拌，使之完全溶解，116°C高压灭菌20分钟，冷却后备用；B液10XHank’ s液5. 0ml、乳清蛋白水解物1. 0g、酵母浸出液5. 0g、丙酮酸钠 0. 8g、示蛋白胨3. 0g、硫代硫酸钠0. lg、0. 酚红10ml、青霉素400U/ml、去离子水545ml以上各成分混合，搅拌，使之完全溶解，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存备用；C液健康马血清140ml将A液、B液和C液充分混合均勻，lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7. 6，制得猪肺炎支原体液体培养基。固体培养基在1000ml液体培养基的基础上添加琼脂8. Og实施例2本发明培养基的制备液体培养基A液脑心浸出液4. 5g、PPLO肉汤4. 0g、去离子水260ml
以上各成分混合，搅拌，使之完全溶解，116°C高压灭菌20分钟，冷却后备用；B液10XHank，s液3. 0ml、乳清蛋白水解物1. 25g、酵母浸出液4. 5g、丙酮酸钠 1. 0g、示蛋白胨1. 5g、硫代硫酸钠0. 135g、0. 酚红17ml、青霉素200U/ml、去离子水560ml以上各成分混合，搅拌，使之完全溶解，用0. 22 μ m滤器过滤除菌，4°C保存备用；C液健康马血清160ml将A液、B液和C液充分混合均勻，lmol/L氢氧化钠调整pH至7. 8，制得猪肺炎支原体液体培养基。固体培养基在1OOOml液体培养基的基础上添加琼脂IOg实施例3本发明培养基的制备液体培养基A液脑心浸出液5. 0g、PPLO肉汤1. 5g、去离子水200ml以上各成分混合，搅拌，使之完全溶解，116°C高压灭菌20分钟，冷却后置4°C保存B液10XHank’ s液1. 0ml、乳清蛋白水解物3. 0g、酵母浸出液3. 0g、丙酮酸钠 2. 5g、示蛋白胨1. 0g、硫代硫酸钠0. 5g、0. 酚红20ml、青霉素200U/ml、去离子水579ml以上各成分混合，搅拌，使之完全溶解，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存备用；C液健康马血清200ml将A液、B液和C液充分混合均勻，lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7. 7，制得猪肺炎支原体液体培养基。固体培养基在1000ml液体培养基的基础上添加琼脂7. Og实施例4本发明猪肺炎支原体培养基与现有技术中几种培养基的比较试验1本发明培养基与现有技术中几种培养基活菌滴度比较试验1. IMhp菌株和培养条件将购自中国兽医药品监察的猪肺炎支原体CVCC355济南系Z株、ATCC引进猪肺炎支原体25934J株和自行分离鉴定的猪肺炎支原体DJ-166株分别接种本发明的猪肺炎支原体培养基和现有技术的3种培养基，种子继代复壮后，分别按 10% (V/V)的比例接种，37°C培养，当培养基的颜色变黄、pH由7. 6降至6. 8 6. 9时，无菌取出培养物。1. 2活菌滴度(CCU)测定每个菌株取12只无菌试管，每管装4. 5ml含猪肺炎支原体培养基，在第1管加入0. 5ml生长良好的培养物，混合均勻后，吸取0. 5ml加入第2根管， 如此进行10倍系列稀释至最末1管，同时设未加菌液的猪肺炎支原体培养基作为阴性对照。试验管设三个重复。之后，将试管放置37°C恒温箱中静止培养，每日观察1次，主要观察培养基的颜色变化和浑浊度，连续观察时间为14日，最后发生颜色变化的小管稀释度即为该培养物的CCU滴度。此试验共进行了 3次。2 结果2. 1猪肺炎支原体Z株接种4种培养基3次生长试验CCU (颜色变化单位)测定结果见表1。表1猪肺炎支原体Z株接种4种培养基3次生长试验CXU测定结果
权利要求
1.一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于主要由A液和B液和C液和/或琼脂组成；A 液由脑心浸出液、PPLO肉汤、去离子水组成；B液由lOXHank’ s液、乳清蛋白水解物、酵母浸出液、丙酮酸钠、示蛋白胨、硫代硫酸钠、0. 酚红、青霉素、去离子水组成；C液为健康马血清。
2.权所述的猪肺炎支原体培养基，其特征在于上述成分的配比如下A液脑心浸出液 2. 0 5. 0g,PPLO 肉汤 1. 5 5. 0g、去离子水 200 300ml ；B 液10XHank，s 液 1. 0 5. 0ml、乳清蛋白水解物1. 0 3. 0g、酵母浸出液3. 0 5. 0g、丙酮酸钠0. 8 2. 5g、示蛋白胨1. 0 3. 0g、硫代硫酸钠0. 1 0. 5g、0. 酚红10 20ml、青霉素200 400u/ml、去离子水500 600ml ；C液健康马血清140 200ml ；琼脂7. 0 10g。
3.权所述的猪肺炎支原体培养基，其特征在于上述成分的配比如下A液脑心浸出液4. 5g、PPLO肉汤4. 0g、去离子水260ml ；B液10 XHank，s液3. 0ml、乳清蛋白水解物 1. 25g、酵母浸出液4. 5g、丙酮酸钠1. 0g、示蛋白胨1. 5g、硫代硫酸钠0. 135g、0. 酚红 17ml、青霉素200u/ml、去离子水560ml ；C液健康马血清160ml ；琼脂10g。
4.权、1-3任一项所述的猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于制备步骤如下①按配比称取A液各成分，将各成分混合，搅拌，使之完全溶解，116°C高压灭菌20分钟，冷却后备用；②按配比称取B液各成分，将各成分混合，搅拌，使之完全溶解，用0.22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存备用；③按配比称取C液成分，将A液、B液和C液充分混合均勻，用lmol/L氢氧化钠溶液调整PH至7. 6 7. 8，即得猪肺炎支原体培养基。
5.权4所述的猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于还可进一步包括如下步骤按配比称取琼脂，加入步骤③制得的培养基中，混合均勻。
全文摘要
本发明提供一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法，属于兽医生物学技术领域。本发明的猪肺炎支原体液体基础培养基组成成分为脑心浸液、乳清蛋白水解物、PPLO肉汤、酵母浸粉、示蛋白胨、硫代硫酸钠、Hank’s液、丙酮酸钠、0.1％酚红溶液、青霉素和去离子水，使用前加入健康马血清。在液体培养基中加入琼脂，得到猪肺炎支原体的固体培养基。本发明的猪肺炎支原体培养基活菌滴度可达1×109CCU/ml～1×1010CCU/ml；活菌滴度和分离的敏感性均远远高于现有技术的培养基，猪肺炎支原体生长速度快、分离的敏感性强；该培养基制备方法工艺简单，可操作性强，适合工业化大生产。
文档编号C12N1/20GK102154167SQ20111000123
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者张峰, 王海燕, 石松, 赵亚荣, 车艳杰, 闫国辉, 高洁, 高玉梅 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司