专利名称：无精症相关基因Fish检测方法和相关检测探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病相关基因检测技术领域，更具体地，涉及无精症相关融合基因检测技术领域，特别是指一种无精症相关基因FiSh检测方法和相关检测探针及试剂盒。
背景技术：
严重少精症和无精症是男性不育的主要原因之一。导致严重少精症和无精症的因素包括染色体数目和结构异常，微生物感染、药物影响等。近年发现Y染色体长臂AZF区 (精子发生区)存在微缺失现象，该现象与严重少精症和无精症相关。AZF区上存在三个亚区(AZFa，AZFb, AZFc)，各亚区包含的位点在男性生殖细胞发育的不同时期起着不同的作用，位点的缺失可致患者表现为少、弱精症或无精症从而引发不育。一般认为，Y染色体的近端缺失(涉及AZFa和AZFb)，表现严重生精障碍，Y染色体的远端缺失(涉及AZFb远段和AZFc)，则残留岛状的生精正常区域。临床表现为少，弱精症。目前多用PCR法扩增AZF特征位点来检测AZF区缺失。但来自不同实验室中的 AZF缺失发生率差异很大，从2%到10%不等，并常发现有假阳性和假阴性。表明PCR法的诊断标准尚待完善。FISH为分子生物学(探针)与细胞遗传学(染色体)相结合，检测染色体异常的新技术，已作为一种快速、准确、直观的分子遗传学技术广泛应用于膀胱癌、乳腺癌、血液系统疾病诊断及预后判断中，但对于应用FISH技术进行无精症相关基因检测的临床研究，国内外尚不多见。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种无精症相关基因 Fish检测方法和相关检测探针及试剂盒，该检测方法设计巧妙，操作简单，特异性和敏感性均能大幅提高，可以快速、准确、直观检测出无精症相关基因，检测结果准确可靠，从而可作为医师诊断无精症的参考依据，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种无精症相关基因Fish检测方法，其特点是，对人染色体展片进行常规预处理，然后采用检测探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述无精症相关基因。人染色体展片可以是人的任何部位的染色体展片，例如人外周血染色体展片。所述检测探针可以是根据Y染色体长臂AZF区设计的任何探针，较佳地，所述检测探针是DAZ检测探针，其中DAZ为NCBI中GeneBank编号为AC053490. 2的核苷酸序列。所述DAZ可以采用任何合适的标记。更佳地，所述DAZ采用Cy3标记。在本发明的第二方面，提供了一种用于上述的无精症相关基因Fish检测方法的检测探针，其特点是，所述检测探针是DAZ检测探针，其中DAZ为NCBI中GeneBank编号为 AC053490. 2的核苷酸序列。所述DAZ可以采用任何合适的标记。较佳地，所述DAZ采用Cy3标记。
在本发明的第三方面，提供了一种无精症相关基因Fish检测试剂盒，其特点是， 包括检测探针容器，所述检测探针容器内具有DAZ检测探针，其中DAZ为NCBI中GeneBank 编号为AC053490. 2的核苷酸序列。所述DAZ可以采用任何合适的标记。较佳地，所述DAZ采用Cy3标记。本发明的有益效果在于本发明的无精症相关基因Fish检测方法通过对人染色体展片进行常规预处理，然后采用检测探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述无精症相关基因，设计巧妙，操作简单，特异性和敏感性均能大幅提高，可以快速、准确、直观检测出无精症相关基因，检测结果准确可靠，从而可作为医师诊断无精症的参考依据，适于大规模推广应用。
具体实施例方式为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。下列具体实施例采用的试剂、仪器、耗材和步骤具体如下I 试剂I. IDNA 探针:采用无精症相关基因DAZ红色探针，探针用Cy3标记，产生红色信号。在_20°C下避光保存。溶解在含有硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺和SSC的缓冲液中。DAZ序列相关信息见下表，其在NCBI (美国国立生物技术信息中心)中的GeneBank编号为AC053490. 2。
GeneChromosomeRefSeqBACDAZYqll. 223NM—004081. 5RP11-140H231.2DAPI 复染液-20°C避光保存。125ng/mL。溶解在含有1，4_苯二胺、甘油的缓冲液中。I. 3NP-40 室温保存。非离子去垢剂。I. 420 X SSC 柠檬酸钠和氯化钠。用浓盐酸调pH 5. 3后过滤灭菌，室温保存半年。I. 5胃蛋白酶2000-3000U/mg。溶解在 IOmM HCl 中。I. 61 XPBS:磷酸缓冲液I. 7100XMgCl2 :2M MgCl2。I. 8 二甲苯。I. 9 浓盐酸12N HCl。I. IONaOH IN NaOH。
I. 11 纯净水。I. 12 封片胶。I. 13 甲酰胺。分装4 °C保存。I. 14 变性液35mL甲酰胺，5mL 20XSSC，补水到50mL。调pH到7. 0-8. O。4°C下可保存I周，使用前测pH。I. 15梯度乙醇:75%，85 %和 95% 乙醇。I. 16 洗脱液 I O. 4XSSC,O. 3% NP-40o 20mL 20XSSC，3mL NP-40，补水到 I 升。用 IN NaOH 调 pH到7. 5。过滤灭菌。室温下可保存半年。I. 17 洗脱液 2 2 X SSC, O. 1% NP-40o IOOmL 20 X SSC, ImL NP-40，补水到 I 升。用 IN NaOH 调 pH 到7. 5。过滤灭菌。室温下可保存半年。2仪器与耗材2. I 载玻片。2. 2 盖玻片。2. 3移液管，枪头:1-200 μ L02. 4 离心管I. 5_50mL2. 5 计时器。2. 6磁力搅拌器。2. 7涡旋振荡器。2. 8手持离心机2. 9台式离心机。2. 10 量筒。5OmL2. 11 水浴锅。2. 12 湿盒。2. 13空气培养箱。2. 14 镊子。2. 15 染色缸。50mL2. 16突光显微镜。蓝绿通道2. 17pH 计，pH 试纸。2. 18 温度计。0072]3实验步骤0073]3. I洗片和烤片0074]3. I. I将人染色体展片用95%乙醇室温水化5min，2次。0075]3. I. 275%乙醇室温水化5min，2次。0076]3. I. 3在60°C烘箱中烤片lhi*。0077]3. 2预处理0078]3. 2. IlXPBS 室温洗涤 5min，2 次。0079]3. 2. 2蛋白酶消化用25uL胃蛋白酶盖片，37°C消化5-15min。0080]3. 2. 31 XPBS 室温洗涤 5min。0081]3. 2. 475%，85%，95%梯度乙醇脱水5min各I次。0082]3. 2. 5室温晾干。0083]3. 3人染色体展片变性0084]3. 3. I在湿盒中铺满湿润的纸巾，在37°C培养箱中预热。0085]3. 3. 2将变性液从4°C中取出复温到室温，转移到水浴锅中70°C预热。0086]3. 3. 3变性前测量变性液温度。将人染色体展片浸没于变性液中，70°C变性5min，每个染色缸中最多放入4张展片。0087]3. 3. 4立即将展片转移到室温75%，85%，95%梯度乙醇中，脱水5min各I次。0088]3. 3. 5吸干展片上的液体，晾干。0089]3. 4检测探针预处理0090]3. 4. I将检测探针从_20°C中取出复温到室温，略微振荡离心。0091]3. 4. 2检测探针70°C水浴5min。0092]3. 4. 3立即冰浴检测探针待用。0093]3. 5探针杂交0094]3. 5. I取20 μ L检测探针覆盖在展片上，取盖片覆盖，小心排除气泡。0095]3. 5. 2用封片胶封片。0096]3. 5. 3将封好的片子在80°C预热的铁板上共变性5min。0097]3. 5. 4将展片转移到37°C预热的湿盒中，杂交过夜(约16hi0。0098]3. 6洗脱0099]3. 6. 170°C预热洗脱液1，室温复温洗脱液2。0100]3. 6. 2用镊子小心去掉封片胶，揭开盖片。0101]3. 6. 3将展片立即转移到70°C预热的洗脱液I中，洗脱2min。0102]3. 6. 4将展片转移到洗脱液2中，洗脱5min。0103]3. 6. 5将展片转移到梯度乙醇中，脱水5min各I次。0104]3. 6. 6避光日京干。0105]3. 7复染0106]3. 7. I取15 μ L DAPI盖片，镜检或4°C保存至I周。0107]3. 8镜检0108]3. 8. I在荧光显微镜下观察，利用UV激发波长观察蓝色染色体信号，利用绿色激
发观察杂交在染色体上的检测探针发出的红色信号。
3. 8. 2选择背景干净，杂交信号清晰，细胞核大小一致，无重叠，核边界完整，DAPI 染色均一的区域摄像。3. 8. 3判读标准。23对染色体中最小的染色体为Y染色体，其中正常细胞为Y染色体上能够看到橙红色信号，表明检测探针杂交在Y染色体上， 无精症相关基因存在，为无精症阴性细胞。异常细胞为Υ染色体上不能看到橙红色信号，表明检测探针无法杂交在Y染色体上，无精症相关基因不存在，为无精症阳性细胞。实施例II、样本材料来源从医院取得无精症病患的外周血染色体展片样本和正常人的外周血染色体展片样本。2、样本检测采用上述方法处理和检测样本。3、检测结果使用DAZ检测探针杂交中，如果橙红色信号点为正常，没有出现橙红色信号点为无精症阳性。统计无精症病患的外周血染色体展片样本的100个细胞，能观察到90个以上的细胞的Y染色体上不能看到橙红色信号，表明检测探针无法杂交在Y染色体上，无精症相关基因不存在，为无精症阳性细胞。统计正常人的外周血染色体展片样本的100个细胞，能观察到90个以上的细胞的Y染色体上能看到橙红色信号，表明检测探针能杂交在Y染色体上， 无精症相关基因存在，为无精症阴性细胞。因此，本诊断方法能获得90%以上的特异性和敏感性。综上所述，本发明的无精症相关基因Fish检测方法设计巧妙，操作简单，特异性和敏感性均能大幅提高，可以快速、准确、直观检测出无精症相关基因，检测结果准确可靠， 从而可作为医师诊断无精症的参考依据，适于大规模推广应用。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图
应被认为是说明性的而非限制性的。
权利要求
1.一种无精症相关基因FiSh检测方法，其特征在于，对人染色体展片进行常规预处理，然后采用检测探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述无精症相关基因。
2.根据权利要求I所述的无精症相关基因Fish检测方法，其特征在于，所述检测探针是DAZ检测探针，其中DAZ为NCBI中GeneBank编号为AC053490. 2的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的无精症相关基因Fish检测方法，其特征在于，所述DAZ采用 Cy3标记。
4.一种用于根据权利要求I所述的无精症相关基因Fish检测方法的检测探针，其特征在于，所述检测探针是DAZ检测探针，其中DAZ为NCBI中GeneBank编号为AC053490. 2的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的检测探针，其特征在于，所述DAZ采用Cy3标记。
6.一种无精症相关基因Fish检测试剂盒，其特征在于，包括检测探针容器，所述检测探针容器内具有DAZ检测探针，其中DAZ为NCBI中GeneBank编号为AC053490. 2的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的无精症相关基因Fish检测试剂盒，其特征在于，所述DAZ采用Cy3标记。
全文摘要
本发明涉及一种无精症相关基因Fish检测方法，对人染色体展片进行常规预处理，然后采用检测探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在无精症相关基因，较佳地，检测探针是DAZ检测探针，其中DAZ为NCBI中GeneBank编号为AC053490.2的核苷酸序列，还涉及相关的检测探针及试剂盒，本发明的无精症相关基因Fish检测方法和相关检测探针设计巧妙，操作简单，特异性和敏感性均能大幅提高，可以快速、准确、直观检测出无精症相关基因，检测结果准确可靠，从而可作为医师诊断无精症的参考依据，适于大规模推广应用。
文档编号C12Q1/68GK102605045SQ20111002462
公开日2012年7月25日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者白小萍, 谭睿, 赵翊均 申请人:江苏百帝生物科技有限公司