专利名称：分离差异表达基因未知序列的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地是基因生物技术的差异表达基因分离方法。
背景技术：
不同发育阶段、病理状态或药物处理细胞的基因mRNA差异表达谱分析技术，目前国内外的方法和技术有mRNA差异显示(DD)技术、荧光定量RT - PCR、cDNA基因芯片；但是，至今国内外未见用于mRNA差异表达的未知基因分离与克隆的芯片技术集成，本项目采用液态和微流控芯片技术实现mRNA差异表达基因分离与新基因克隆的芯片化。从而，弥补或替代现有mRNA差异显示技术假阳性过高、cDNA基因芯片不能发现与克隆未知序列新基因、荧光定量PCR不能规模化等技术难点。进行未知基因的分析与新基因的克隆是现代生 物技术、医药技术的关键技术瓶颈，应用于疾病相关基因的病理诊断分析与疾病相关基因克隆、具有治疗作用的功能基因克隆，以及药用蛋白质或药物分子次生代谢相关酶的基因分离与克隆。用于分离与克隆差异表达的未知序列新基因的微流控或液体芯片和配套试剂盒，可广泛应用于医药、农业与生物技术等实验室、疾病诊断与动植物检疫部门、天然药物分析与药物分子发现等领域。目前，在比较分析与分离克隆差异表达基因的技术有mRNA差异显示技术、差减杂交法，以及基因芯片等方法，基因芯片对已知序列基因片段杂交，差减杂交法采用基因组的杂交膜或培养皿菌株杂交方法，工作量大、效率低、成本高，mRNA差异显示技术采用随机引物等PCR、电泳、切胶等方法耗时耗力，而且克隆重复片断、假阳性高。本发明采用固相或液相芯片原理，进行差减杂交分离与克隆差异表达基因的方法，实现了差异表达未知序列基因分析与克隆的芯片技术集成化。
发明内容
发明目的解决细胞特异性表达的未知序列基因的分离与克隆技术问题，用于不同发育阶段、病理状态或药物处理细胞等差异表达的功能基因未知序列分离、克隆的生物芯片类产品。I、一种分离差异表达基因的技术方法，其特征在于包括以下几个步骤
1)、将芯片或多孔板或微珠以化学方法连接多聚核糖核苷酸(PolydT)；
2)、常规提取2种或以上细胞的TotalRNA或mRNA ；
3)、用一种TotalRNA或mRNA与芯片或多孔板或磁珠上的多聚核糖核苷酸(Poly dT)在逆转录酶和缓冲液下合成单链cDNA ；
4)、加热变性，采用PBS缓冲液洗涤合成以上cDNA的RNA模板；
5)、将另一种细胞的总RNA或mRNA与以上cDNA进行杂交；
6)、用移液枪吸出留下未杂交的RNA到PCR反应的0.5ml离心管；
7)、将离心管内的RNA加多聚核糖核苷酸(PolydT)、逆转录酶和缓冲液下合成单链cDNA ；
8)、以上7)合成的单链cDNA加热变性去除RNA模板后，进行常规方法的双链cDNA合
成；
9)、采用常规方法克隆双链cDNA，并进行序列测定。2、所表述的芯片或多孔板或微珠为固定多聚核糖核苷酸(Poly dT)的一种基质或载体，可以是固相芯片的玻璃、石英或有机聚合物分子，也可以是液相芯片的各类微珠带磁性或非带磁性的载体。磁性复合微粒是由高分子或无机材料与磁性超细粉末构成的具有超顺磁性的胶态材料。磁性复合微粒可在外加磁场中被快速分离。通过物理吸附或其表面功能基团(如羧基、羟基、氨基等)的作用，以不同组成的微米级磁性复合微粒为材料，将oligo (dT)通过共价键作用或亲和素而固定在磁性复合微粒的表面，将表面硅烷化含氨基末端的磁性Fe_30_4微粒以苯二异硫氰酸酯活化,进而将氨基标记的oligo (dT)_(20)共价偶联在其表面。 3、所表述的进行差异表达基因分离的方法，其2种或2种以上的相对应细胞群体的细胞适合于各种类型的生物和各种不同生理、病理或药物处理的细胞。同类技术比较目前技术有1) mRNA差异显示技术，缺点是非特异性、假阳性、重复性，采用测序级聚苯稀氨电泳分离基因片段；2) cDNA微阵列基因芯片技术，大规模点阵列基因杂交而分析已知序列的基因，比较分析差异表达基因的功能；3)差减方法的基因组杂交技术，采用菌落杂交或试管反应，程序复杂、工作量大、灵敏度低。发明的效果快速、方便、灵敏和设计合理，mRNA差异显示技术可用于克隆未知序列新基因的生物芯片集成，可提供规模化、常规化基因生物技术实验室使用。摘要
本发明公开了一种分离与克隆差异表达功能基因未知序列的方法，采用多孔板或磁性微珠为载体，每个孔底部或磁株直接联接以化学合成方法连接多聚核糖核苷酸(PolydT)，比较细胞差异表达基因分析，采用Total RNA或mRNA加逆转录酶与缓冲液与PolydT在位合成cDNA，加热变性除去mRNA，然后再与进行比较分析的细胞Total RNA或mRNA杂交的方法，从而实现差异表达基因的分离与克隆，本方法综合了基因差减杂交方法与mRNA差异显示(DD)技术的原理，可以实现差异基因表达分析与克隆未知序列基因的技术芯片化。
权利要求
1.一种分离差异表达基因的技术方法，其特征在于包括以下几个步骤 1)、将芯片或多孔板或微珠以化学方法连接多聚核糖核苷酸(PolydT)； 2)、常规提取2种或以上细胞的TotalRNA或mRNA ； 3)、用一种TotalRNA或mRNA与芯片或多孔板或磁珠上的多聚核糖核苷酸(Poly dT)在逆转录酶和缓冲液下合成单链cDNA ； 4)、加热变性，采用PBS缓冲液洗涤合成以上cDNA的RNA模板； 5)、将另一种细胞的总RNA或mRNA与以上cDNA进行杂交； 6)、用移液枪吸出留下未杂交的RNA到PCR反应的0.5ml离心管； 7)、将离心管内的RNA加多聚核糖核苷酸(PolydT)、逆转录酶和缓冲液下合成单链cDNA ； 8)、以上7)合成的单链cDNA加热变性去除RNA模板后，进行常规方法的双链cDNA合成； 9)、采用常规方法克隆双链cDNA，并进行序列测定。
2.如权利要求书I所表述的芯片或多孔板或微珠为固定多聚核糖核苷酸(PolydT)的一种基质或载体，可以是固相芯片的玻璃、石英或有机聚合物分子，也可以是液相芯片的各类微珠带磁性或非带磁性的载体。
3.如权利要求书I所表述的进行差异表达基因分离的方法，其2种或2种以上的相对应细胞群体的细胞适合于各种类型的生物和各种不同生理、病理或药物处理的细胞。
全文摘要
本发明公开了一种分离与克隆差异表达功能基因未知序列的方法，采用多孔板或磁性微珠为载体，每个孔底部或磁株直接联接以化学合成方法连接多聚核糖核苷酸(PolydT)，比较细胞差异表达基因分析，采用Total RNA或mRNA加逆转录酶与缓冲液与PolydT在位合成cDNA，加热变性除去mRNA，然后再与进行比较分析的细胞Total RNA或mRNA杂交的方法，从而实现差异表达基因的分离与克隆，本方法综合了基因差减杂交方法与mRNA差异显示(DD)技术的原理，可以实现差异基因表达分析与克隆未知序列基因的技术芯片化。
文档编号C12N15/10GK102676497SQ201110064090
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者曾杰 申请人:曾杰