专利名称：一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及耐药突变的检测技术，特别涉及一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术用于检测结核分枝杆菌链霉素耐药突变。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。到20世纪80年代后期，由于贫困、艾滋病、人口流动和耐药等因素，结核病发病率和死亡率在全球范围内出现快速回升，成为与艾滋病并列的全球性危害最严重的传染病。结核分枝杆菌耐药情况严重，耐药率高达46%，给结核病的预防和治疗构成严峻挑战。抗结核药物是结核病化学治疗的基础，而结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手段。链霉素发现于20世纪40年代，是最早出现的有效抗结核药物，也是治疗结核病的一线药物之一(1、李志忠，高全金.链霉素在当今抗结核中的地位[J]中国误诊学杂志， 2002.2(1) :62-63)。链霉素是一种氨基环醇糖苷类抗生素，主要作用于结核分枝杆菌的核糖体，与结核分枝杆菌的核糖体30S亚单位结合，诱导遗传密码的错配，抑制mRNA翻译的开始，干扰翻译过程中的校对，从而抑制蛋白质的合成。链霉素经常单独给药，因此其耐药性发展较快。结核分枝杆菌耐链霉素的主要分子机制是编码小亚基的S12蛋白的rpsL基因和编码16S核糖体RNA的rrs基因突变，从而抑制药物结合核糖体的能力，造成对链霉素耐药 (2、张晨钰，梁建琴.结核分枝杆菌耐药分子机制的研究进展[J]中国误诊学杂志.2006， 6(17) =3303-3305)。结核分枝杆菌链霉素耐药性的检测对于控制耐药性结核分枝杆菌的传播以及控制结核病有极其重要的意义。目前临床上采用的耐药检测方法可分为表型检测和基因型检测两类，并以前者为主(3、Heifets L. Rapid automated methods(BACTEC System)in clinical mycobacteriology[J]Semin Respir Infect, 1986. 1(4) :242-249)。然而表型检测因为各种原因，如耗时、设备昂贵、有放射性危害或干扰因素多等，难以形成快速高效的筛查手段。相对而言，基因检测更为直接，目前已经使用的基因分析方法有单链构象多态性分析法(SSCP)，限制性片段长度多态性分析法(RFLP)，DNA测序法，线性探针杂交法(4、 Mokrousov I. Multicenter evaluation of reverse line blot assay for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates[J].J Microbiol Methods，2004. 57(3) :323-335)，RNA/RNA 错配分析法，以及 DNA 阵列(芯片)检测等(5.Wu X.Detection of streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates using four molecular methods in China[J]. Yi Chuan Xue Bao,2006. 33(7) 655-663)。这些方法虽然检出率和通量高低不同，但共同缺点是需要进行PCR后处理，不仅影响了检测效率，易引起扩增产物污染，而且增加了操作难度，提高了对实验室的要求。实时PCR技术将扩增和检测两步骤合一，具有快速、特异、灵敏、定量等优点，已在病原微生物检测和突变检测领域得到广泛应用，近年来在结核菌耐药检测上的应用也引起人们极大兴趣(6>El-Hajj H. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons[J]. J Clin Microbiol,2001.39(11) 4131-4137)。荧光PCR技术则是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度。(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无需PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性。(3)可实现单管双重检测，降低成本。(4)不接触有毒试剂，操作安全。( 根据探针与靶序列杂交的特异性以及与不完全匹配靶序列杂交的Tm值差异，可以利用熔解曲线区分野生与突变，结果容易判读。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种有效提高灵敏度及特异性、操作简便、周期短的结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法，即一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术。本发明的另一目的在于提供一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒。所述结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法包括以下步骤1)根据结核分枝杆菌全序列和结核分枝杆菌基因组rpsL和rrs基因序列，利用引物设计软件I^rimer Premier 5设计引物和探针；2)提取结核分枝杆菌样本的DNA ；3)构建PCR反应体系；4)进行PCR扩增及熔解曲线分析将步骤2)提取的DNA加入步骤3)的PCR反应体系中，设阴性对照、空白对照和阳性对照，进行PCR扩增及熔解曲线分析，将待测样本反应管所得熔解曲线与阳性对照反应管所得熔解曲线的Tm值进行比较，判断出待测样本中 rpsL及rrs基因上耐药相关突变位点是否发生突变，从而判断样本耐药情况。在步骤1)中，所述设计引物和探针的具体方法为a，引物设计在所检测的突变两端，探针覆盖突变位点；b，探针的荧光基团可选择FAM、R0X、HEX、CY5、TET、CAL-Fluor等任意一种，淬灭基团可选择BHQ、Dabcyl等，并且探针可以进行各种类型的修饰(如LNA标记)等。所述引物和探针的具体序列可为
引物 rpsL43F5'-CAGCCCGCAGCGTCGTGGTGT-3‘
引物 rpsL43R5'-GTGGCCCTCGCCGGGAA-3‘
引物 rpsL88F5'-GCACTCGATGGTGCTGGTGC-3 ‘
引物 rpsL88R5'-CGTGCCTGTTTGCGGTTCTT-3‘
引物 rrs512F5'-ACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTCC-3
引物 rrs512R5'-GTTAAGCCGTGAGATTTCACGAACAA-3
引物 rrs904F5'-GGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTG-3‘
引物 rrs904R5'-GCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTC-3‘
探针 rpsL43P5'-FAM-CCGCGCCACTCCGAAGAAGCCGAACTCCGCGG-Dabcyl-3'
探针 rpsL88P5'-TET-CCGTCCGGGTGAAGGACCTGCCTGACGG-Dabcyl-3'
探针 rrs512P5'-FAM-CGCACCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGCG-Dabcyl-3'
探针 rrs904P5'-TET-CCGCGGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGCGCGG-Dabcyl-3'
在步骤幻中，所述PCR反应体系可为一种是rpsL体系，用来检测rpsL基因相关
耐药突变(rpsL密码子43和rpsL密码子88)，另一种是rrs体系，用来检测rrs基因相关耐药突变(rrs512环区和rrs904环区)，反应液每份为20 μ 1，每份反应液中含下列组分rpsL 体系1XPCR Buffer [IOmM Tris-HCl, 50mM KC1,50% (v/v)甘油]，dATP、 dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl2ImM,引物 rpsL43R 和 rpsL88R 各 0. 6 μ M，引物 rpsL43F 和 rpsL88F 各 0. 06 μ Μ,探针 rpsL43P 和 rpsL88P 各 0. 06 μ Μ, Taq DNA 聚合酶 2U， UNG 酶 0. OlU ；rrs 体系1XPCR Buffer [1 Ommol/L Tris, 50mmol/L KC1,50 % (v/v)甘油]， dATP、dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl23mM，引物 rrs512R 和 rrs904R 各 0· 6 μ M， 引物 rrs512F 和 rrs904F 各 0. 06 μ Μ、探针 rrs512P 和 rrs904P 各 0. 06 μ Μ, Taq DNA 聚合酶 2U，UNG 酶 0. 01U。有经验的人也选择其它类型的buffer，或者通过优化找到更为合适的buffer类型。在步骤4)中，所述 PCR 扩增的条件为50 V 2min，95 V IOmin ；95 V 10s、 70 °C 20s (每个循环降低1°C )、75°C 20s构成一个touchdown循环(共进行10个循环)； 950C 108、601208(荧光数据采集)、751208构成一个循环(共进行30个循环)；之后是熔解分析步骤，95°C 2min、40°C 2min、40°C 80°C每0. 5°C采集荧光。所述结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒设有盒体、扩增试剂(包括STRPCR Mix A、STR PCR Mix B和TB酶混合液)、TB DNA提取液、TB阴性对照和STR阳性对照；所述扩增试剂(包括STR PCR Mix A、STR PCR Mix B和TB酶混合液)、TB DNA提取液、TB阴性对照和STR阳性对照放置在盒体内。所述STR PCR Mix A 包括 IXPCR Buffer (IOmM Tris-HCl, 50mM KC1,50% (v/v) 甘油)，dATP、dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl2ImM,引物 rpsL43R 和 rpsL88R 各 0. 6 μ M，引物 rpsL43F 和 rpsL88F 各 0. 06 μ Μ,探针 rpsL43P 和 rpsL88P 各 0. 06 μ Μ。所述STR PCR Mix B 包括 IXPCR Buffer (IOmM Tris,50mM KC1,50% (v/v)甘油)， dATP、dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl23mM，引物 rrs512R 和 rrs904R 各 0· 6 μ M， 引物 rrs512F 和 rrs904F 各 0. 06 μ Μ,探针 rrs512P 和 rrs904P 各 0. 06 μ Μ。所述TB酶混合液包括2U Taq, 0. OlU UNG。所述STR阳性对照为STR野生型标准质粒。所述TB阴性对照可以为TB DNA提取液，也可以为H20、Tris或生理盐水等。所述TB DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX_100。所述结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒检验标本的方法包括以下步骤
1)试剂准备——配液区①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为取 nX 19. 6 μ LSTR PCR Mix A和nXO. 4 μ L酶混合液加入到1. 5mL离心管中，振荡混勻数秒， 3000rpm离心数秒；另取ηΧ19. 6μ L STR PCR Mix B和nXO. 4 μ L酶混合液加入到另一 1. 5mL离心管中，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒。配好的PCR反应液必需贮存在_20°C并在4h内使用。②PCR反应液的分装。PCR反应液A/B分别以每管20 μ L分装于PCR薄壁反应管。③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20°C直至样品提取处理完毕。2)样品提取及加样——提取区①固体培养基上生长的结核分枝杆菌，用22SWG标准接种环收集细菌1环，并悬在 250 μ L TB DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取lmL，IOOOOrpm离心15min， 丢弃上清并在250 μ L TB DNA提取液中重悬细菌。②封口膜封口，99°C加热20min。14000rpm离心lOmin，转移上清到新1. 5mL离心
管。上清即为PCR扩增模板。(模板可保存于-20°C，并于1个月内完成试验。注意不要反复冻融样品。)③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品 5uL0立即盖严管盖。④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。
3) PCR扩增-扩增区①仪器的程序设定如下第一步50°C2min，95°C IOmin ；第二步95°C10s，70°C 20s (每个循环降低 1°C )，75°C 20s, 10 个循环；第三步95°C10s,60°C 20s, 75°C 20s, 30 个循环，60°C 20s 处收集荧光信号；第四步95°C2min，40°C 2min ；第五步40 80°C，每0. 5°C收集荧光信号，荧光通道选用FAM和ΤΕΤ。②程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。(3)试剂盒的参考值(参考范围)阳性对照，即野生型在各体系及各通道中的Tm值范围如下 反应体系A中FAM通道野生型对照峰的Tm值为57. 0°C 士 1 °C ；TET通道野生型对照峰的Tm值为65.0°C 士 1°C。反应体系B中FAM通道野生型对照峰的Tm值为63. 5°C 士 1 °C ；TET通道野生型对照峰的Tm值为60. 0°C 士 1°C。其中各Tm值是在特定Bio-Rad CFX96仪器上所得的常见值，作为参考。当使用其它仪器时，Tffl值可能略有变动，以当次试验阳性对照(野生型)所得的Tm值为准。Tm值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上Tm值时，请参考阳性对照和阴性对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时，可通过调整基线或直接人工判读的方法获得Tm值。
(4)结果判读通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异判断样品是否发生突变。当四个通道中样品的熔点与阳性对照的熔点均一致(误差不超过rc )时判定为野生型，试验菌株对链霉素敏感；样品的熔点低于阳性对照2°c及以上时(ΔΤω>2 ) 判定为突变型，试验菌株对链霉素耐药。关于杂合样品结果的判读当四个通道中任一通道熔解曲线出现双峰或融合峰时即为杂合样品，分3种情况①当样品出现双峰时，即为杂合样品；②样品为一个融合峰，与阳性对照的熔点一致，但峰型与阳性对照的峰型有较大差异，在有可能出现突变峰的位置出现小峰或突起，即为杂合样品；③样品为一个融合峰，为突变熔点，但在野生峰的位置出现小峰或突起，即为杂合样品。杂合样品对链霉素耐药，建议出现杂合样品时将样品重复检测，以确定样品耐药性。实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输、保存不当或试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降，出现假阴性或检测不准确的结果。本发明的具体原理是利用4对靶核苷酸序列的特异性引物和4条特异性荧光探针，分别于两管中实验，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用实时PCR技术实现靶核苷酸序列的核算片段扩增以及之后的熔解曲线分析。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸链。在探针为自由状态时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在体系中存在大量可与探针结合的单链扩增子时，探针与扩增子结合使得荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，荧光报告基团发出荧光。这样在熔解分析的过程中，随着温度的变化探针与扩增子的结合状态反应在荧光信号的改变上，而通过比较与探针完全匹配以及不完全匹配的靶序列在荧光信号改变上的差异即可判断出待测样本在耐药突变位点是否发生突变，从而判断样本耐药情况。本发明在PCR 程序结束之后，直接增加一个熔解分析步骤即可对耐药相关位点是否突变进行判断。此方法不用进行PCR后处理，降低了污染以及假阳性出现的概率。荧光PCR熔解曲线法特异性好，可以快速、准确地检测结核分枝杆菌链霉素耐药常见突变，有望直接用于临床样本链霉素耐药性检测。本发明的突出优点如下(1)由于本发明采用荧光PCR熔解曲线法作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其它核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果。(2)操作简便，且对PCR产物进行实时监测，大大节省了检测时间。(3)由于各试剂用量均较少，大大降低了成本。
图1为rpsL43位点典型熔解曲线结果图。在图1中，横坐标为温度，纵坐标为荧光强度与温度的负导数(-dF/dT)，曲线1和2为rpsL43位点突变峰，曲线3为rpsL43位点野生峰，曲线4为空白对照。图2为rpsL88位点典型熔解曲线结果图。在图2中，横坐标为温度，纵坐标为荧光强度与温度的负导数(-dF/dT)，曲线1、2和3为rpsL88位点突变峰，曲线4为rpsL88位点野生峰，曲线5为空白对照。图3为rrs513位点典型熔解曲线结果图。在图3中，横坐标为温度，纵坐标为荧光强度与温度的负导数(-dF/dT)，曲线1和2为rrs513位点突变峰，曲线3为rrs513位点野生峰，曲线4为空白对照。图4为1TS905位点典型熔解曲线结果图。在图4中，横坐标为温度，纵坐标为荧光强度与温度的负导数(-dF/dT)，曲线1为rrs905位点突变峰，曲线2为rrs905位点野生峰，曲线3为空白对照。图5为本发明所述结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒实施例结构示意图。
具体实施例方式实施例1引物和探针设计根据结核分枝杆菌野生型基因组序列在四个位点各设计多对引物和探针，引物 3'端无互补序列。引物、探针序列组合可为弓丨物 rpsL43F:5 ‘ -CAGCCCGCAGCGTCGTGGTGT-3‘弓丨物 rpsL43R:5 ‘ -GTGGCCCTCGCCGGGAA-3‘弓丨物 rpsL88F:5 ‘ -GCACTCGATGGTGCTGGTGC-3‘弓丨物 rpsL88R:5 ‘ -CGTGCCTGTTTGCGGTTCTT-3‘引物 rrs512F:5 ‘ -ACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTCC-3‘引物 rrs512R:5 ‘ -GTTAAGCCGTGAGATTTCACGAACAA-3‘弓丨物 rrs904F:5 ‘ -GGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTG-3‘弓丨物 rrs904R:5 ‘ -GCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTC-3‘探针rpsL43P 5' -FAM-CCGCGCCACTCCGAAGAAGCCGAACTCCGCGG-Dabcyl-3'探针 rpsL88P 5 ‘ -TET-CCGTCCGGGTGAAGGACCTGCCTGACGg-Dabcyl-3‘探针rrs512P:5 ‘ -FAM-CGCACCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGCG-Dabcyl-3‘探针 rrs904P:5 ‘ -TET-CCGCGGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGCGCGG-Dabcyl-3‘弓丨物及探针均由上海生工生物有限公司合成。
实施例2提取结核分枝杆菌基因组DNA用热裂解法提取结核分枝杆菌基因组DNA，具体过程是A、固体培养基上生长的结核分枝杆菌，用22SWG标准接种环收集细菌1环，并悬在 250 μ L TB DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取lmL，IOOOOrpm离心15min， 丢弃上清并在250 μ L TB DNA提取液中重悬细菌。B、封口膜封口，99°C加热20min。14000rpm离心lOmin，转移上清到新1. 5mL离心
管。上清即为PCR扩增模板。C.样本保存于-20°c，并于1个月内完成试验。注意不要反复冻融样本。实施例3反应体系的建立和优化利用野生型结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA作为待检样本，分装后储存于-20°C备用。2. 1引物比例的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，调整上下游引物的比例，将引物比例分别调至1 5、1 IOU 15和1 20，经过重复实验选定1 10为上下游引物的比例。2. 2MgCl2浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将MgCl2的浓度以 lmmol/L至5mmol/L以lmmol/L递增，经过重复实验选定lmmol/L(rpsL体系)和3mmol/ L(rrs体系)为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。2. 3Taq酶用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果， 选定2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌链霉素耐药突变的反应体系为25 μ 1体系，所需各组分及相应浓度见表1和表2。表1荧光PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌链霉素rpsL基因耐药突变反应中的各组分情况，表2荧光PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌链霉素rrs基因耐药突变反应中的各组分情况表权利要求
1.一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法，其特征在于包括以下步骤1)根据结核分枝杆菌全序列和结核分枝杆菌基因组rpsL和rrs基因序列，利用引物设计软件Primer Premier 5设计引物和探针；2)提取结核分枝杆菌样本的DNA；3)构建PCR反应体系；4)进行PCR扩增及熔解曲线分析将步骤2、提取的DNA加入步骤幻的PCR反应体系中，设阴性对照、空白对照和阳性对照，进行PCR扩增及熔解曲线分析，将待测样本反应管所得熔解曲线与阳性对照反应管所得熔解曲线的Tm值进行比较，判断出待测样本中rpsL 及rrs基因上耐药相关突变位点是否发生突变，从而判断样本耐药情况。
2.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述设计引物和探针的具体方法为a，引物设计在所检测的突变两端，探针覆盖突变位点；b，探针的荧光基团可选择FAM、R0X、HEX、CY5、TET、CAL-Fluor中的任意一种，淬灭基团选择 BHQ、Dabcyl。
3.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述引物和探针的具体序列为引物 rpsL43F5'-CAGCCCGCAGCGTCGTGGTGT-3'引物 rpsL43R5'-GTGGCCCTCGCCGGGAA-3'引物 rpsL88F5'-GCACTCGATGGTGCTGGTGC-3'引物 rpsL88R5'-CGTGCCTGTTTGCGGTTCTT-3'引物 rrs512F5'-ACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTCC-3'引物 rrs512R5'-GTTAAGCCGTGAGATTTCACGAACAA-3'引物 rrs904F5'-GGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTG-3'引物 rrs904R5'-GCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTC-3'探针 rpsL43P5'-FAM-CCGCGCCACTCCGAAGAAGCCGAACTCCGCGG-Dabcyl-3'探针 rpsL88P5'-TET-CCGTCCGGGTGAAGGACCTGCCTGACGG-Dabcyl-3'探针 rrs512P5'-FAM-CGCACCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGCG-Dabcyl-3'探针 rrs904P5'-TET-CCGCGGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGCGCGG-Dabcyl-3'。
4.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述PCT反应体系为一种是rpsL体系，用来检测rpsL基因相关耐药突变，另一种是rrs体系，用来检测rrs基因相关耐药突变，反应液每份为20 μ 1，每份反应液中含下列组分rpsL 体系1XPCR Buffer [1 Ommol/L Tris, 50mmol/L KC1，50 % (v/v)甘油]， 200ymol/L dATP、200 μ mol/L dCTP、200 μ mol/L dGTP、400 μ mol/L dUTP, Immo 1/L MgCl2, 引物 rpsL43R 和引物 rpsL88R 各 0. 6 μ mol/L，引物 rpsL43F、引物 rpsL88F、探针 rpsL43P 和探针 rpsL88P 各 0. 06 μ mol/L, Taq DNA 聚合酶 2U，UNG 酶 0. OlU ；rrs 体系1XPCR Buffer [ IOmmo 1/L Tris, 50mmol/L KC1，50 % (v/v)甘油]， 200 μ mol/L dATP、200ymol/L dCTP、200 μ mol/L dGTP、400 μ mol/L dUTP, 3mmol/LMgCl2, 引物 rrs512R 和引物 rrs904R 各 0. 6 μ mol/L，引物 rrs512F、引物 rrs904F、探针 rrs512P 和探针 rrs904P 各 0. 06 μ mol/L, Taq DNA 聚合酶 2U, UNG 酶 0. 01U。
5.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法，其特征在于在在步骤4)中，所述PCR扩增的条件为50°C 2min，95°C IOmin ；95°C 10s、70°C 20s，每个循环降低1°C、75°C 20s构成一个touchdown循环，共进行10个循环；95°C 10s,60°C 20s、 75°C 20s构成一个循环，共进行30个循环；之后是熔解分析步骤，95°C 2min、4(TC 2min、 40 80°C每0. 5°C采集荧光。
6.如权利要求1所述的结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒，其特征在于设有盒体、扩增试剂、TB DNA提取液、TB阴性对照和STR阳性对照；所述扩增试剂包括STR PCR Mix A、STR PCR Mix B 和 TB 酶混合液，STR PCR Mix A、STR PCR Mix B、TB 酶混合液、 TB DNA提取液、TB阴性对照和STR阳性对照放置在盒体内；所述 STR PCR Mix A 包括 1 XPCR Buffer, dATP、dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl2ImM,弓 I 物 rpsL43R 和 rpsL88R 各 0. 6 μ M，引物 rpsL43F 和 rpsL88F 各 0. 06 μ Μ,探针卬81^43 和卬81^88 各0.06“]\1;所述81^€61~为101111 Tris-HCl, 50mM KC1,50% (v/v)甘油；所述 STR PCR Mix B 包括 IXPCR Buffer, dATP、dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl23mM,弓 I 物 rrs512R 和 rrs904R 各 0. 6 μ M，引物 rrs512F 和 rrs904F 各 0. 06 μ Μ,探针 rrs512P 和 rrs904P 各 0. 06μΜ，所述 Buffer 为 IOmM Tris,50mM KCl，50% (ν/ν)甘油；所述TB酶混合液包括2U Taq, 0. OlU UNG ；所述STR阳性对照为STR野生型标准质粒；所述TB阴性对照为TB DNA提取液、H2O, Tris或生理盐水；所述TB DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。
7.如权利要求6所述的结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒检验标本的方法，其特征在于包括以下步骤1)试剂准备——配液区①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温，PCR反应液配液标准为取 nX 19. 6 μ LSTR PCR Mix A和nXO. 4 μ L酶混合液加入到1. 5mL离心管中，振荡混勻数秒， 3000rpm离心数秒；另取ηΧ19. 6μ L STR PCR Mix B和nXO. 4 μ L酶混合液加入到另一 1. 5mL离心管中，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒，配好的PCR反应液必需贮存在_20°C并在4h内使用；②PCR反应液的分装，PCR反应液A/B分别以每管20μ L分装于PCR薄壁反应管；③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间，贮存在-20°C直至样品提取处理完毕；2)样品提取及加样——提取区①固体培养基上生长的结核分枝杆菌，用22SWG标准接种环收集细菌1环，并悬在 250 μ L TB DNA提取液中，液体培养基中生长的结核分枝杆菌取lmL，IOOOOrpm离心15min， 丢弃上清并在250 μ L TB DNA提取液中重悬细菌；②封口膜封口，99°C加热20min，14000rpm离心lOmin，转移上清到新1.5mL离心管，上清即为PCR扩增模板；③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5yL;立即盖严管盖；④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区； 3) PCR扩增-扩增区①仪器的程序设定如下 第一步50°C 2min，95°C IOmin ；第二步95°C 10s，70°C 20s，每个循环降低1°C，75°C 20s，10个循环； 第三步95°C 10s，60°C 20s, 75°C 20s, 30个循环，60°C 20s处收集荧光信号； 第四步:95°C 2min，40°C 2min ；第五步40 80°C，每0. 5°C收集荧光信号，荧光通道选用FAM和TET ；②程序运行完毕，将PCR薄壁反应管取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理； (3)试剂盒的参考值阳性对照，即野生型在各体系及各通道中的Tm值范围如下反应体系A中FAM通道野生型对照峰的Tm值为57. 0°C 士 1°C ；TET通道野生型对照峰的 Tm 值为 65.0°C 士 1°C ；反应体系B中FAM通道野生型对照峰的Tm值为63. 5°C 士 1°C ；TET通道野生型对照峰的 Tm 值为 60. 0°C 士 1°C ；其中各Tm值是在特定Bio-Rad CFX96仪器上所得的常见值，作为参考。当使用其它仪器时，Tffl值可能略有变动，以当次试验阳性对照所得的Tm值为准；Tm值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上Tm值时，请参考阳性对照和阴性对照的峰型选择有效1值；当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时，通过调整基线或直接人工判读的方法获得Tm值。
全文摘要
一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法及试剂盒。涉及耐药突变的检测技术，提供一种有效提高灵敏度及特异性、操作简便、周期短结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法。根据结核分枝杆菌全序列和结核分枝杆菌基因组rpsL和rrs基因序列，设计引物和探针；提取结核分枝杆菌样本的DNA；构建PCR反应体系；进行PCR扩增及熔解曲线分析。利用特异性引物和探针，分别于两管中实验，采用耐热DNA聚合酶、四种核苷酸单体等成分，并应用实时PCR技术实现靶核苷酸序列的核算片段扩增以及之后的熔解曲线分析。荧光PCR熔解曲线法特异性好，可快速、准确地检测结核分枝杆菌链霉素耐药常见突变，有望直接用于临床样本链霉素耐药性检测。
文档编号C12Q1/68GK102229991SQ20111013824
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者张婷, 李庆阁, 胡思玉 申请人:厦门大学, 厦门致善生物科技有限公司