专利名称：一种利用固定化细胞制备大豆肽的方法
技术领域：
本发明涉及利用固定化微生物细胞制备大豆肽的方法，属酶工程技术领域。
背景技术：
大豆肽是由2-10个氨基酸残基组成的低肽混合物，它具有易吸收、易消化、促进矿物质吸收、抗氧化、增强免疫力等多方面的理化特性，除了富有营养、易消化外，还有低抗原性、抑制胆固醇、促进脂肪代谢及促进微生物发酵等生物学功能。作为新一代超级蛋白营养素，大豆肽已广泛地应用于食品保健及饲料行业，具有广阔的应用和市场前景。目前，大豆肽的生产方法主要有酶解法和发酵法。酶解法由于使用高价格的酶而提高了大豆肽的生产成本，因而限制了其的应用；而发酵法会使发酵液中含有大量菌体蛋白和其它杂质，不利于产物的分离纯化，也导致生产成本增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定化细胞制备大豆肽的方法，可以简便的收集转化液进行大豆肽的制备，并反复使用，简化工艺过程，提高底物利用率，有利于工业化生产过程中的自动控制。本发明所采用的技术方案如下
在本发明中，用于大豆肽生产的菌种为地衣芽孢杆菌(Bacillus lichen!form!s)。培养基及培养条件 ⑴种子培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至lOOOmL，pH7. 2-7. 4，经0. IMPa高压蒸气灭菌 30min备用；
⑵摇瓶培养基
大豆分离蛋白30g-45g，NaCl 5g_6g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min备用；
⑶发酵转化培养液
大豆分离蛋白80g-120g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min备 该方法利用固定化细胞制备大豆肽，其步骤如下 ⑴菌种活化
取斜面保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌种接入种子培养基中37°C 培养Mh ；
⑵菌种扩大培养与菌体细胞的收集
将上述菌种接到摇瓶培养基中，装液量为SO-IOOmLASOmL三角瓶，接种量为2%_5%，于350C -37°CU50r/min-200r/min振荡培养18h_Mh，然后将培养液离心收集菌体； ⑶菌体细胞固定化
将所收集的菌体细胞和一定量的包埋剂混合均勻，滴入成型剂中固化成型，即得固定化菌体细胞；
⑷大豆肽的转化
将上述固定化细胞胶体装柱，将发酵转化培养液流经凝胶柱进行生物转化，收集流出的转化液，转化液可重复上柱，直到培养液中80%-90%的底物被转化为止。ω大豆肽粉的制备
将上述转化液浓缩至合适浓度，即可得到大豆肽浓缩液，大豆肽浓缩液经过喷雾干燥即得大豆肽粉。上述步骤⑶中所述的包埋剂为海藻酸钠；成型剂为氯化钙溶液。上述步骤⑶中所述的包埋剂海藻酸钠的浓度为1_5%，菌体细胞的量为10-20% ；成型剂氯化钙的浓度为1_5%，固化时间为2-3h，固化温度为30-40°C。上述步骤⑷中所述的发酵转化培养液流速为200_500mL/h，转化温度为35_40°C。本发明利用地衣芽孢杆菌固定化细胞的方法生产大豆肽，不仅可以简便的收集转化液进行大豆肽的制备，并可反复使用，简化了工艺过程，提高了底物的利用率，使底物的大豆肽转化率可达到50%以上，产品得率可达45%以上，且有利于工业化生产过程中的自动控制。
具体实施例方式实施例1
1.培养基 ⑴一种种子培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至lOOOmL，pH7. 2-7. 4，经0. IMPa高压蒸气灭菌 30min备用；
⑵一种摇瓶培养基
大豆分离蛋白30g，NaCl 5g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min
⑶一种发酵转化培养液
大豆分离蛋白80g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min备用。2.菌种的扩大培养与菌体细胞的收集
取斜面保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌种接入种子培养基中37°C 培养Mh。将上述菌种接到摇瓶培养基中，装液量为50-100mL/250mL三角瓶，接种量为5%， 于37°C、180r/min振荡培养20h，然后将培养液离心收集菌体。3.菌体细胞固定化
将所收集的菌体细胞按1 :5的比例与浓度为5%的海藻酸钠包埋剂混合均勻，滴入浓度为5%的氯化钙、温度为40°C的成型剂中固化成型2h，即得固定化菌体细胞。4.大豆肽的转化将上述固定化细胞装柱，将发酵转化培养液流经凝胶柱进行生物转化，发酵转化培养液流控制为300mL/h，收集流出的转化液，转化液可重复上柱，直到培养液中的80%-90%的底物被转化为止。5.大豆肽粉的制备
将上述转化液浓缩至合适浓度，即可得到大豆肽浓缩液，大豆肽浓缩液经过喷雾干燥即得大豆肽粉。实施例2 1.培养基
⑴一种种子培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至lOOOmL，pH7. 2-7. 4，经0. IMPa高压蒸气灭菌 30min备用；
⑵一种摇瓶培养基
大豆分离蛋白35g，NaCl 5g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min
⑶一种发酵转化培养液
大豆分离蛋白100g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min备用。2.菌种的扩大培养与菌体细胞的收集
取斜面保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌种接入种子培养基中37°C 培养Mh。将上述菌种接到摇瓶培养基中，装液量为SOmLASOmL三角瓶，接种量为3%，于 35°C,200r/min振荡培养Mh，然后将培养液离心收集菌体。3.菌体细胞固定化
将所收集的菌体细胞按1 :5的比例与浓度为5%的海藻酸钠包埋剂混合均勻，滴入浓度为1%的氯化钙、温度为35°C的成型剂中固化成型3h，即得固定化菌体细胞。4.大豆肽的转化
将上述固定化细胞装柱，将发酵转化培养液流经凝胶柱进行生物转化，发酵转化培养液流控制为250mL/h，收集流出的转化液，转化液可重复上柱，直到培养液中的底物 80%-90%的底物被转化为止。5.大豆肽粉的制备
将上述转化液浓缩至合适浓度，即可得到大豆肽浓缩液，大豆肽浓缩液经过喷雾干燥即得大豆肽粉。实施例3 1.培养基
⑴一种种子培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至lOOOmL，pH7. 2-7. 4，经0. IMPa高压蒸气灭菌 30min备用；
⑵一种摇瓶培养基
大豆分离蛋白45g，NaCl 6g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min⑶一种发酵转化培养液
大豆分离蛋白120g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min备用。2.菌种的扩大培养与菌体细胞的收集
取斜面保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌种接入种子培养基中37°C 培养Mh。将上述菌种接到摇瓶培养基中，装液量为SOmLASOmL三角瓶，接种量为3%，于 37°CU80r/min振荡培养18h，然后将培养液离心收集菌体。3.菌体细胞固定化
将所收集的菌体细胞按1 :5的比例与浓度为1%的海藻酸钠包埋剂混合均勻，滴入浓度为5%的氯化钙、温度为38°C的成型剂中固化成型2. 5h，即得固定化菌体细胞。4.大豆肽的转化
将上述固定化细胞装柱，将发酵转化培养液流经凝胶柱进行生物转化，发酵转化培养液流控制为200mL/h，收集流出的转化液，转化液可重复上柱，直到培养液中的底物 80%-90%的底物被转化为止。5.大豆肽粉的制备
将上述转化液浓缩至合适浓度，即可得到大豆肽浓缩液，大豆肽浓缩液经过喷雾干燥即得大豆肽粉。实施例4 1.培养基
⑴一种种子培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至lOOOmL，pH7. 2-7. 4，经0. IMPa高压蒸气灭菌 30min备用；
⑵一种摇瓶培养基
大豆分离蛋白35g，NaCl 5g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min
⑶一种发酵转化培养液
大豆分离蛋白100g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min备用。2.菌种的扩大培养与菌体细胞的收集
取斜面保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌种接入种子培养基中37°C 培养Μι。将上述菌种接到摇瓶培养基中，装液量为50mL/250mL三角瓶，接种量为3%，于 35°C,200r/min振荡培养Mh，然后将培养液离心收集菌体。3.菌体细胞固定化
将所收集的菌体细胞按1 :5的比例与浓度为3%的海藻酸钠包埋剂混合均勻，滴入浓度为m的氯化钙、温度为30°C的成型剂中固化成型3h，即得固定化菌体细胞。4.大豆肽的转化
将上述固定化细胞装柱，将发酵转化培养液流经凝胶柱进行生物转化，发酵转化培养液流控制为250mL/h，收集流出的转化液，转化液可重复上柱，直到培养液中的底物 80%-90%的底物被转化为止。
5.大豆肽粉的制备
将上述转化液浓缩至合适浓度，即可得到大豆肽浓缩液，大豆肽浓缩液经过喷雾干燥即得大豆肽粉。
权利要求
1.一种利用固定化细胞制备大豆肽的方法，其步骤如下⑴培养基的制备①种子培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至lOOOmL，pH7. 2-7. 4，经0. IMPa高压蒸气灭菌 30min备用；②摇瓶培养基大豆分离蛋白30g-45g，NaCl 5g_6g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min备用；③发酵转化培养液大豆分离蛋白80g-120g，加水至lOOOmL，pH值自然，经0. IMPa高压蒸气灭菌30min备用；⑵菌种活化取斜面保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌种接入种子培养基中37°C 培养Mh ；⑶菌种扩大培养与菌体细胞的收集将上述菌种接到摇瓶培养基中，装液量为SO-IOOmLASOmL三角瓶，接种量为3%_5%，于 350C -37°CU50r/min-200r/min振荡培养18h_Mh，然后将发酵液离心收集菌体；⑷菌体细胞固定化将所收集的菌体细胞和一定量的包埋剂混合均勻，滴入成型剂中固化成型，即得固定化菌体细胞；ω大豆肽的转化将上述固定化细胞胶体装柱，将发酵转化培养液流经凝胶柱进行生物转化，收集流出的转化液，转化液可重复上柱，直到培养液中80%-90%的底物被转化为止；(6)大豆肽粉的制备将上述转化液浓缩至合适浓度，即可得到大豆肽浓缩液，大豆肽浓缩液经过喷雾干燥即得大豆肽粉。
2.根据权利要求1所述的利用固定化细胞制备大豆肽的方法，其特征在于步骤⑵中所述的菌种为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
3.根据权利要求1所述的利用固定化细胞制备大豆肽的方法，其特征在于步骤⑷中所述的包埋剂为海藻酸钠。
4.根据权利要求1所述的利用固定化细胞制备大豆肽的方法，其特征在于步骤⑷中所述的成型剂为氯化钙溶液。
5.根据权利要求1所述的利用固定化细胞制备大豆肽的方法，其特征在于步骤⑷中所述的包埋剂海藻酸钠的浓度均为1_5%，菌体细胞的量为10-20%，成型剂氯化钙的浓度为 1-5%，固化时间为2-3h，固化温度为30-40°C。
6.根据权利要求1所述的利用固定化细胞制备大豆肽的方法，其特征在于步骤( 中所述的发酵转化培养液流速为200-500mL/h，转化温度为35_40°C。
全文摘要
本发明公开了一种利用固定化细胞制备大豆肽的方法，其特点是采用发酵转化培养液作底物，将含地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的固定化细胞，通过菌种活化、菌种扩大培养与菌体细胞收集、菌体细胞固定化、生物转化、浓缩和喷雾干燥制备大豆肽。本发明利用地衣芽孢杆菌固定化细胞的方法生产大豆肽，不仅可以简便的收集转化液进行大豆肽的制备，并可反复使用，简化了工艺过程，提高了底物的利用率，使底物的大豆肽转化率可达到50%以上，产品得率可达45%以上，且有利于工业化生产过程中的自动控制。
文档编号C12N11/04GK102321710SQ20111019571
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者史咏华, 李盘欣, 段新颖, 王实玉, 邵伟, 黄亚男 申请人:河南省南街村(集团)有限公司