专利名称：一株淡黄色链霉菌突变菌株，构建方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体地说是一株淡黄色链霉菌突变菌株，构建方法及其用途，利用基因敲除手段获得了一株不产氨莎三烯类杂质的淡黄色链霉菌突变菌株CGMCC 4948，以及其应用于萨菲菌素的发酵。 萨菲菌素(Sanglifehrin A，缩写成SFA，结构式如下，是由淡黄色链霉菌 Streptomyces flavolus DSM 9卯4产生的聚酮-聚肽类杂合天然产物(J. Antibiot. (Tokyo) 1999，52，466-473)。在目前已经分离到了 20余种SFA结构类似物(J. Am. Chem. Soc. 2002，124,4257-4270)中，以SFA的免疫抑制活性最高。除了具有很强的免疫抑制活性外(J. Immunol. 2001，166,7165-7171 J. Immunol. 2003，171，542-546)，SFA 还具有很强的抑制 HIV (J. Virol. 2004，78，12800-12808)，HCV (Intern. Patent. App 1. W0/2006/138507) 以及阻止由于线粒体MPTP病理性开孔导致的严重的心肌死亡的活性(J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009，330，670-678.)。
与目前临床使用的免疫抑制剂环孢菌素(Cyclosporin Α,缩写成CsA)、FK506和雷帕霉素(Rapamycin，缩写成Rapa)相比，SFA既存在相似的作用机制也具有不同的效应机制(J. Am. Chem. Soc. 2003，125，3849-3859)。上述三种药物的发挥免疫抑制活性的方式都是先和一个初级蛋白作用而后再和效应蛋白作用发挥活性。Π(506和Rapa首先作用于一个共同的初级靶蛋白FKBP形成各自的复合物，随后n(506-FKBP作用于效应蛋白蛋白钙调磷酸酶(Calcineurin)而Rapa-FKBP则作用于FRAP发挥免疫抑制活性。相似的CsA和 SFA都作用于一个相同的初级靶蛋白CypA，CsA-CypA复合体再和Calcineurin作用发挥免疫抑制活性，然而SFA-CypA复合物的效应蛋白不同于上述三种药物，至今还未阐明。由于上述三种免疫抑制剂作用的效应蛋白Calcineurin和FRAP具有非常关键的生理作用，因此这些药物通常也可以导致一些严重的肾毒性和中枢毒性副作用(Circulation 1996，94， 1209-1211) ；SFA具有不同的作用机制，不存在类似的毒副作用，因此其有望被开发成为新一代高效低毒的免疫抑制剂。
背景技术：
SFA的化学合成最初由Nicolaou小组在1999年首次完成(Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999，38，2447-2451)，全过程 54 步，总产率 0. 9% 2 年后 Paquette 小组又以 64 步、0. 06% 的收率完成了全合成(J.Am. Chem. Soc. 2002,1 ，4257-4270)。由于 SFA 化学结构复杂，因此以化学合成方式制备SFA以及其结构类似物非常的不经济和不高效。相反以生物合成为基础的代谢工程和组合生物合成方法往往可以方便的引入结构多样性。本发明人此前克隆了 SFA的生物合成基因簇并解析了其生物合成基机理(Mol. BioSyst. 2011，7， 852-861)。其生物合成是由一型聚酮合成酶0 和聚肽合成酶NRPS催化完成的。首先利用巴豆先辅酶A为底物，经过巴豆先辅酶A还原酶的还原羧化，再由氨化酶的酰氨化合成起始单元；而后PKS利用丙二酰，甲基丙二酰辅酶A和2-氧-丁基丙二酰辅酶A为缩合底物经过13步的缩合形成聚酮长链；再经过NRPS催化完成3肽缩合将缬氨酸，m-酪氨酸和哒嗪酸依次缩合至聚酮-聚肽链上；最后在末端缩合功能域的催化下完成分子内环化形成大环内酯。由于S. flaveolus在产生SFA的同时还产生了大量的其他杂质化合物，因此在实际生产过程中，分离纯化SFA需要多步复杂工序，成本高昂。此前国际上曾报道，通过敲除阿维菌素(Avermectin)产生菌S. avermitilis中编码聚酮杂质组份的生物合成基因可以彻底去除发酵组份中相应的杂质，大大提高了阿维菌素的比率并简化后续纯化工艺(Chem. Rev. 1997，97，2591-2610)。因此本专利中，本发明人采用类似的思路，从分离纯化鉴定杂质组份的结构出发，克隆杂质组份的生物合成基因簇，利用基因敲除手段阻断了杂质氨莎三烯的生物合成，达到了净化萨菲菌素发酵组份的目的。利用本发明人发明的从转录组中克隆活跃表达的生物合成基因簇的方法(论文已投稿)，首先克隆到了 5对活跃转录的新的一型聚酮合成酶(H(S)和一对新的非核糖体聚肽合成酶(NRPS)基因。通过对SFA发酵液中主要的杂质组份分离纯化和结构鉴定，证实了这些主要杂质为如下结构式的氨莎三烯类抗生素具体为1 三烯环菌素ACTrienomycin A)，2 三烯环菌素B (Trienomycin B)，3 氨莎三烯A (Ansatrienin A)和4 硫噻唑三烯环菌素E (Thiozinotrienomycin E)。而后利用上述PKS和NRPS基因片段作为探针筛选基因文库，克隆到了一个包含上述所有PKS和NRPS基因片段的85. 398kb的生物合成基因簇(5 组PKS基因分别位于基因簇中mycDl，mycD2，mycD3, mycD4, mycD5基因中，NRPS基因位于
mycC基因中)。根据基因序列的分析，推测其极可能为氨莎三烯类杂质的生物合成基因簇。
权利要求
1.一株来源于淡黄色链霉菌Mi^ptomyces flaveolus的基因工程突变菌株，一株基因置换的突变菌株的菌种保藏编号为CGMCC 4948，或者一株对淡黄色链霉菌Mi^ptomyces flaveolus氨莎三烯生物合成基因簇中mycC、mycDl、mycD2、mycD3、mycD4和mycD5基因进行基因中断获得的突变菌株。
2.如权利要求1所述的突变菌株，其特征在于所述的保藏编号为CGMCC4948突变菌种对淡黄色链霉菌氨莎三烯生物合成基因簇中myCA2-myCD2即包含mycA2，mycA3, mycA4, mycBl, mycB2, mycB3, mycB4, mycB5, mycFl, mycC, mycB6, mycB7, mycDl 禾口 mycD2 基因区域进行基因置换，可以获得不产氨莎三烯的突变菌株。
3.如权利要求2所述的突变菌株，其特征在于缺失了权利要求2中所述的 mycA2-mycD2基因区域，其基因簇中还剩余了 17个完整的基因和2个不完全的基因。具体为1)负责聚酮骨架形成的I型线性聚酮合成酶0 基因，即myCD3，myCD4，myCD5和一个缺失了部份氮端序列的mycD2共4个基因mycD3位于基因簇核苷酸序列第7771-17814个碱基处，长度为10044个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3347个氨基酸；mycD4位于基因簇核苷酸序列第17859-27881个碱基处，长度为10023个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3340个氨基酸；mycD5位于基因簇核苷酸序列第27918-37862个碱基处，长度为9945个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3314个氨基酸；缺失了部份氮端序列的mycD2位于基因簇核苷酸序列第5609-7708个碱基处，长度为 2100个碱基对，不能正确编码聚酮合成酶；其和缺失了部份氮端序列的mycA2基因在基因组以EcoRI位点相连；2)负责环己甲酸侧链合成基因，即mycAl和缺失了部份氮端序列的mycA2共2个基因 mycAl位于基因簇核苷酸序列第4984-2930个碱基处，长度为2055个碱基对，编码2，4- 二烯酰辅酶A还原酶，长度为684个氨基酸；缺失了部份氮端序列的mycA2位于基因簇核苷酸序列第5405-5055个碱基处，长度为 351个碱基对，不能正确编码1-环己烯酸还原酶；其和缺失了氮端的mycD2基因在基因组上通过EcoRI位点相连；3)负责聚酮骨架关环的基因，即mycE共1个基因mycE位于基因簇核苷酸序列第37867-38649个碱基处，长度为783个碱基对，编码 N-乙酰转移酶，长度为260个氨基酸；4)负责后修饰的基因，即mycF2，mycF3和mycF4共3个基因mycF2位于基因簇核苷酸序列第38673-40307个碱基处，长度为1635个碱基对，编码核黄素依赖的单氧化酶，长度为544个氨基酸；mycF3位于基因簇核苷酸序列第40353-413 个碱基处，长度为972个碱基对，编码氧甲基转移酶，长度为323个氨基酸；mycF4位于基因簇核苷酸序列第44866-45711个碱基处，长度为846个碱基对，编码酯化酶，长度为281个氨基酸；5)负责调节的基因，即mycGl，mycG2和mycG3共3个基因mycGl位于基因簇核苷酸序列第H859个碱基处，长度为观59个碱基对，编码调控因子，长度为952个氨基酸；mycG2位于基因簇核苷酸序列第44867-43806个碱基处，长度为1062个碱基对，编码调控因子，长度为353个氨基酸；mycG3位于基因簇核苷酸序列第56094-55087个碱基处，长度为1008个碱基对，编码调控因子，长度为335个氨基酸；6)未知功能基因，即mycHl，mycH2, mycH3, mycH4和mycH5共5个基因 mycHl位于基因簇核苷酸序列第42484-43077个碱基处，长度为594个碱基对，编码硝基还原酶，长度为197个氨基酸；mycH2位于基因簇核苷酸序列第46348-45764个碱基处，长度为585个碱基对，编码位置蛋白，长度为194个氨基酸；mycH3位于基因簇核苷酸序列第47994-49019个碱基处，长度为10 个碱基对，编码环氧水解酶，长度为341个氨基酸；mycH4位于基因簇核苷酸序列第49149-50255个碱基处，长度为1107个碱基对，编码 PE-PGRS家族蛋白，长度为368个氨基酸；mycH5位于基因簇核苷酸序列第53736-50362个碱基处，长度为3375个碱基对，编码丝氨酸羧端蛋白酶，长度为IlM个氨基酸，
4.如权利要求1所述的，其特征在于所述的淡黄色链霉菌的氨莎三烯生物合成基因簇，除了权利要求3描述的CGMCC 4948中的17个完整的基因之外还有15个完整基因，共 32个基因，具体为1)负责聚酮骨架形成的I型线性聚酮合成酶0 基因，即mycDl，mycD2,mycD3, mycD4和mycD5共5个基因mycDl位于基因簇核苷酸序列第21702-31373个碱基处，长度为9672个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3223个氨基酸；mycD2位于基因簇核苷酸序列第31409-37012个碱基处，长度为5604个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为1867个氨基酸；mycD3位于基因簇核苷酸序列第37075-47118个碱基处，长度为10044个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3347个氨基酸；mycD4位于基因簇核苷酸序列第47163-57185个碱基处，长度为10023个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3340个氨基酸；mycD5位于基因簇核苷酸序列第57222-67166个碱基处，长度为9945个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3314个氨基酸；2)负责环己甲酸侧链合成基因，即mycAl，mycA2,mycA3和mycA4共4个基因 mycAl位于基因簇核苷酸序列第4984-2930个碱基处，长度为2055个碱基对，编码2，4- 二烯酰辅酶A还原酶，长度为684个氨基酸；mycA2位于基因簇核苷酸序列第5915-5055个碱基处，长度为861个碱基对，编码1_环己烯酸还原酶，长度为286个氨基酸；mycA3位于基因簇核苷酸序列第7081-5912个碱基处，长度为1170个碱基对，编码酰基辅酶A脱氢酶，长度为389个氨基酸；mycA4位于基因簇核苷酸序列第10166-7170个碱基处，长度为四97个碱基对，编码 3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶，长度为998个氨基酸；3)负责AHBA 前体合成基因，艮口 mycBl，mycB2, mycB3, mycB4, mycB5, mycB6, mycB7 禾口 mycA5共8个基因mycBl位于基因簇核苷酸序列第11694-10309个碱基处，长度为1386个碱基对，编码 3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶，长度为461个氨基酸；mycB2位于基因簇核苷酸序列第1M67-11772个碱基处，长度为个696碱基对，编码磷酸酶，长度为231个氨基酸；mycB3位于基因簇核苷酸序列第13705-12563个碱基处，长度为1143个碱基对，编码氧化还原酶，长度为380个氨基酸；mycB4位于基因簇核苷酸序列第14853-13702个碱基处，长度为1152个碱基对，编码 3-氨基5-羟基苯甲酸合成酶，长度为383个氨基酸；mycB5位于基因簇核苷酸序列第15076-15651个碱基处，长度为576个碱基对，编码 3-氨基脱氢奎尼酸脱水酶，长度为191个氨基酸；mycB6位于基因簇核苷酸序列第19300-20187个碱基处，长度为888个碱基对，编码 3-氨基5-羟基苯甲酸激酶，长度为295个氨基酸；mycB7位于基因簇核苷酸序列第21497-20370个碱基处，长度为11 个碱基对，编码 3-氨基脱氢奎尼酸合成酶，长度为375个氨基酸；mycA5位于基因簇核苷酸序列第70725-71555个碱基处，长度为831个碱基对，编码莽草酸/奎尼酸脱氢酶，长度为276个氨基酸；4)负责氨基酸侧链形成的非核糖体聚肽合成酶(NRPQ基因，即mycC，共1个基因 mycC位于基因簇核苷酸序列第16730-19258个碱基处，长度为25 个碱基对，编码非核糖体聚肽合成酶，长度为842个氨基酸；5)负责聚酮骨架关环的基因，即mycE共1个基因mycE位于基因簇核苷酸序列第67171-67953个碱基处，长度为783个碱基对，编码 N-乙酰转移酶，长度为260个氨基酸；6)负责后修饰的基因，即mycFl,mycF2, mycF3和mycF4共4个基因mycFl位于基因簇核苷酸序列第15753-16679个碱基处，长度为927个碱基对，编码 N-乙酰转移酶，长度为308个氨基酸；mycF2位于基因簇核苷酸序列第67977-69611个碱基处，长度为1635个碱基对，编码核黄素依赖的单氧化酶，长度为544个氨基酸；mycF3位于基因簇核苷酸序列第69657-706 个碱基处，长度为972个碱基对，编码氧甲基转移酶，长度为323个氨基酸；mycF4位于基因簇核苷酸序列第74170-75015个碱基处，长度为846个碱基对，编码酯化酶，长度为281个氨基酸；7)负责调节的基因，即mycGl，mycG2和mycG3共3个基因mycGl位于基因簇核苷酸序列第H859个碱基处，长度为观59个碱基对，编码调控因子，长度为952个氨基酸；mycG2位于基因簇核苷酸序列第74171-73110个碱基处，长度为1062个碱基对，编码调控因子，长度为353个氨基酸；mycG3位于基因簇核苷酸序列第85398-84391个碱基处，长度为1008个碱基对，编码调控因子，长度为335个氨基酸；8)负责自我免疫的基因，即mycF5共1个基因mycF5位于基因簇核苷酸序列第75704. . 77149个碱基处，长度为1446个碱基对，编码外排泵，长度为481个氨基酸；9)未知功能基因，即mycHl，mycH2,mycH3, mycH4和mycH5共5个基因mycHl位于基因簇核苷酸序列第71788-72381个碱基处，长度为594个碱基对，编码硝基还原酶，长度为197个氨基酸；mycH2位于基因簇核苷酸序列第75652-75068个碱基处，长度为585个碱基对，编码位置蛋白，长度为194个氨基酸；mycH3位于基因簇核苷酸序列第77四8_78323个碱基处，长度为10 个碱基对，编码环氧水解酶，长度为341个氨基酸；mycH4位于基因簇核苷酸序列第78453-79559个碱基处，长度为1107个碱基对，编码 PE-PGRS家族蛋白，长度为368个氨基酸；mycH5位于基因簇核苷酸序列第83040-79666个碱基处，长度为3375个碱基对，编码丝氨酸羧端蛋白酶，长度为IlM个氨基酸。
5.如权利要求2或3所述的突变菌株的构建方法，其特征在于通过基因置换敲除淡黄色链霉菌中的氨莎三烯的生物合成基因，以权利要求4中的基因簇核苷酸序列中 3383-5392个碱基处的区域为左同源臂，34702-36811个碱基处的区域为右同源臂，以 EcoRI位点连接左臂和右臂，通过基因置换的方法将期间包含的四310个碱基对区域实施敲除的；或者对淡黄色链霉菌Mi^Ptomyces flaveolus氨莎三烯生物合成基因簇中mycC、 mycD 1、mycD2、mycD3、mycD4和mycD5基因进行基因中断获得的突变菌株。
6.一种如权利要求1、2或3所述的突变菌株的用途，其特征在于用于萨菲菌素的生产。
7.—种如权利要求6所述的突变菌株的用途，其特征在于所述的萨菲菌素的生产中阻断氨莎三烯的生物合成。
全文摘要
本发明公开了淡黄色链霉菌(Streptomyces flaveolus)的突变菌株、构建方法及其用途。包括基因置换获得的突变菌株或者基因中断获得的突变菌株。基因置换突变菌株保藏编号为CGMCC 4948，该突变菌株的构建是通过对淡黄色链霉菌敲除部份氨莎三烯生物合成基因实现的。本发明的突变菌株，可以用于萨菲菌素Sanglifehrin A的发酵生产，而不产氨莎三烯类杂质，方便萨菲菌素的分离纯化。
文档编号C12R1/465GK102260644SQ20111019703
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月14日 优先权日2011年7月14日
发明者刘 文, 瞿旭东, 雷春 申请人:中国科学院上海有机化学研究所