专利名称：脊尾白虾EcSSR0003微卫星DNA标记的检测方法
技术领域：
本发明属于分子遗传标记领域，尤其涉及一种脊尾白虾EcSSR0003微卫星DNA标记的检测方法。
背景技术：
微卫星(microsatellites)或称简单序列重复(simple sequence repeats， SSR)是指由1 6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、 多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、 基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。国内外在其他海产甲壳类有相关的研究报道，利用尼龙膜杂交法，Masatsugu takhano等在锯缘青蟹(正_，serraia)中发现5个具有可变性的微卫星位点。 David Gopurenko等在锯缘青蟹(沙_，Scylla paramamosain )的研究中筛选到5个微卫星位点。利用常规方法，E. S Yap等在远海梭子蟹(/^rtozw1S pelagicus)中筛选到7个含有二核苷酸重复单元、1个含有四核苷酸重复单元的微卫星位点。H. S. AN等利用PCR筛选法，在中华绒螯蟹(五riocAeir siZ^Z^is)基因组富集文库中筛选出9个新的微卫星位点。 B. Kinfling等在中华绒螯蟹中筛选到12个具有高度多态性的微卫星位点。刘萍以及徐鹏等开发了中国对虾O^/wero/^/^i^s chinensis)微卫星标记，并用于遗传连锁图谱的构建、系谱认证和群体遗传多样性的分析等；王鸿霞等以人工选育建立的凡纳滨对虾全同胞家系为实验材料，探讨了微卫星标记对混养家系进行亲权鉴定的可能性；栾生建立了日本对虾(Marsupenaeus japonicus )微卫星标记技术；李晓萍等构建了三疣梭子蟹iFortunus triuberbuculatus)基因组富集文库，获得了 30个多态性微卫星标记，并用于群体遗传分析。冯建彬等利用微卫星标记分析了日本沼虾Ofecro^racAiws mipponensis) 9个野生群体遗传多样性。这些重要经济甲壳类的微卫星DNA标记的开发，已应用于亲缘关系鉴定、种群多样性研究中。但是至今为止，尚未见有脊尾白虾微卫星DNA检测技术方面的报道。
发明内容
本发明针对现有技术中尚未有对脊尾白虾微卫星DNA检测方法公开的现状，提供了一种脊尾白虾EcSSR0003微卫星DNA标记的检测方法，本发明可快捷的获得脊尾白虾 EcSSR0003遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出脊尾白虾在此位点的每个个体的基因型。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现
脊尾白虾EcSSR0003微卫星DNA标记的检测方法，所述检测方法包括以下步骤首先提取脊尾白虾基因组DNA并稀释备用；再利用脊尾白虾基因组文库中的EcSSR0003微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对脊尾白虾不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得脊尾白虾在EcSSR0003核心序列区高度遗传变异的多态性图谱；
所述EcSSR0003微卫星核心序列的特异性引物序列分别为正链5’ -AGGCAACAGGACATAACA _3’，负链 3’- CGTACAGATAGACGGAGA _5’，使用特异性引物时的退火温度为51°C。对技术方案的进一步改进所述脊尾白虾基因组DNA的稀释浓度为50ng/^L，每个 PCR反应中加入3μ ，反应总体积为20μ 。对技术方案的进一步改进所述PCR扩增的反应体系为每个PCR反应总体积为 20μ ，包括 50ng/^L 脊尾白虾基因组 DNA3PL ;2. 5mmol/L dNTP 1. 6μ ；含 15 mmol/L Mg2+ 的 10XPCR Buffer 2μ ；5U/^L 的 Taq 酶 0. 2μ ；引物 10mmol/L 各 μ ；最后加 ddH20 至 20μ 。对技术方案的进一步改进使用所述特异性引物时设置PCR仪的程序参数为 95°C预变性5min ；95°C变性45s，51°C退火45s，72°C延伸45s，25个循环；最后72°C再延伸 IOmin ；4°C保存。对技术方案的进一步改进对PCR产物的检测将PCR产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1 1. 5h进行分离；将胶板通过10%的冰醋酸溶液20min —蒸馏水6min — 0. 1%的硝酸银溶液25min — 3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到脊尾白虾在EcSSR0003基因座位高度遗传变异的多态性图谱。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是
首先，应用本发明所述引物和检测方法可以检测脊尾白虾的每个个体在ECSSR0003微卫星核心区的遗传变异，EcSSR0003的PCR引物是本发明的核心，可在脊尾白虾的群体检测中呈现高度遗传变异的多态性，可快捷的获得脊尾白虾的EcSSR0003遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，所得电泳结果可直观地检测出脊尾白虾在此位点的每个个体的基因型，方便、快捷、准确。其次，相对于其它分子遗传标记技术而言，微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，因此，可以区分个体是纯合子和杂合子状态。本发明适用于脊尾白虾群体遗传标记、系谱认证、遗传图谱构建等应用。结合附图阅读本发明的具体实施方式
后，本发明的其他特点和优点将变得更加清林疋。
图1为本发明的ECSSR0003引物对脊尾白虾16个体的检测图谱，编号1_16为脊尾白虾个体，M是标准分子量。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例1
本发明所述脊尾白虾EcSSR0003微卫星核心序列DNA分子标记的检测方法包括以下步
骤首先提取脊尾白虾基因组DNA并稀释备用；再利用脊尾白虾基因组文库中的含有 EcSSR0003微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对脊尾白虾不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得脊尾白虾在 EcSSR0003核心序列区高度遗传变异的多态性图谱(如图1所示)。脊尾白虾在EcSSR0003 核心序列为 ATAACTTTCATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAATTTTTCTC, GenBank 注册号为 JF912422。 1、脊尾白虾基因组DNA的提取
取脊尾白虾肌肉组织lOOmg，剪碎后放入1.5ml离心管中，加入pH8. O的TE溶液 (10mmol/L Tris-CI, 10mmol/L EDTA) 500μ ,用研磨棒研磨。加入 10% SDS 溶液 25μ ， 混勻。加入20mg/ml蛋白酶K 4μ ，混勻，55°C消化2. 5 3h。重蒸酚抽提两次，每次lOmin， 12000转/min离心5min,取上清；酚氯仿(1:1)抽提一次，IOmin, 12000转/min离心5min， 取上清；氯仿抽提一次5min，5000g离心5min，取上清。加入1/25体积的5mol/L NaCl溶液，混勻后再加入两倍体积的一 20°C的无水乙醇沉淀DNA 15min ；挑出的DNA，用70%的乙醇洗涤数十分钟，使DNA干燥，用灭菌水500μ 充分溶解后，定量将其稀释成50ng/^L的浓度备用。2、微卫星引物的设计
在脊尾白虾微卫星富集文库基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，在EcSSR0003核心序列的两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星DNA片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的主要依据。本发明的EcSSR0003微卫星核心序列区域两端的特异性引物序列为正链5’ -AGGCAACAGGACATAACA _3’，负链 3’- CGTACAGATAGACGGAGA _5’，使用该引物时的退火温度为 51°C。3、PCR 扩增
首先加样，PCR扩增体系如下包括50ng/^L脊尾白虾基因组DNA3PL ；2. 5mmol/L dNTP 1.6μ ;含 15 mmol/L Mg2+ 的 10XPCR Buffer2PL ;5U/^L TaqO. 2μ ；本发明的引物 10mmol/L 各 μ ；最后加 ddH20 至 20μ 。其次进行PCR反应，PCR扩增仪程序参数为95°C预变性5min ；95°C变性45s，51°C 退火45s，72°C延伸45s，25个循环；最后72°C再延伸IOmin ；4°C保存。4、PCR产物的检测
PCR反应结束后，将产物在8%的变性聚丙烯酰氨的凝胶中进行电泳，电泳仪的功率为 12W,电泳的时间在1 1. 5h左右，即可终止。将胶板通过10%的冰醋酸溶液20min —蒸馏水6min — 0. 1%的硝酸银溶液25min — 3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即得到如图 1所示的多态性图谱。本发明检测方法主要利用磁珠富集法建立的脊尾白虾微卫星富集文库中 EcSSR0003的微卫星DNA序列，使用Primer (Version 5. 00)软件在其核心序列的两端设计相应的PCR引物，将引物序列合成后对脊尾白虾个体进行PCR扩增，从而快速地检测脊尾白虾每个个体在此微卫星区的遗传变异，从而获得该引物对脊尾白虾在EcSSR0003序列区的遗传变异图谱，通过该图谱直观地表现出每个个体的基因型。 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
权利要求
1.脊尾白虾ECSSR0003微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤首先提取脊尾白虾基因组DNA并稀释备用；再利用脊尾白虾基因组文库中的 EcSSR0003微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对脊尾白虾不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得脊尾白虾在EcSSR0003核心序列区高度遗传变异的多态性图谱；所述EcSSR0003微卫星核心序列的特异性引物序列分别为正链5’ -AGGCAACAGGACATAACA _3’，负链 3’- CGTACAGATAGACGGAGA _5’，使用特异性引物时的退火温度为51°C。
2.根据权利要求1所述的脊尾白虾EcSSR0003微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于所述脊尾白虾基因组DNA的稀释浓度为50ng/^L，每个PCR反应中加入3μ ，反应总体积为 20μ 。
3.根据权利要求1所述的脊尾白虾EcSSR0003微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系为每个PCR反应总体积为20μ ，包括50ng/^L脊尾白虾基因组 DNA3PL ；2. 5mmol/L dNTP 1. 6μ ；含 15 mmol/L Mg2+ 的 IOXPCR Buffer 2μ ；5U/^L 的 Taq 酶 0. 引物 10mmol/L 各 μ ；最后加 ddH20 至 20μ 。
4.根据权利要求1所述的脊尾白虾EcSSR0003微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于使用所述特异性引物时设置PCR仪的程序参数为95°C预变性5min ；95°C变性45s， 51V退火45s，72 °C延伸45s，25个循环；最后72 °C再延伸IOmin ；4 V保存。
5.根据权利要求1所述的的脊尾白虾EcSSR0003微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于对PCR产物的检测将PCR产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1 1. 5h进行分离；将胶板通过10%的冰醋酸溶液20min —蒸馏水6min — 0. 1%的硝酸银溶液 25min — 3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到脊尾白虾在EcSSR0003基因座位高度遗传变异的多态性图谱。
全文摘要
本发明提供了一种脊尾白虾EcSSR0003微卫星DNA标记的检测方法，包括首先提取脊尾白虾基因组DNA并稀释备用；再在EcSSR0003微卫星核心序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对脊尾白虾基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，从而获得脊尾白虾在EcSSR0003核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。应用本发明所述引物和检测方法可以检测脊尾白虾的每个个体在EcSSR0003微卫星核心区的遗传变异，可快捷的获得脊尾白虾的EcSSR0003遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱；本发明适用于脊尾白虾群体遗传标记、系谱认证、遗传图谱构建等应用。
文档编号C12Q1/68GK102304576SQ201110246399
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月24日 优先权日2011年8月24日
发明者刘萍, 李健, 贾舒雯 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所