专利名称：一种nras基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种NRAS基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
NRAS基因是RAS癌基因家族的成员，定位于I号染色体，基因全长85kb，其cDNA长约2. lkb，是一个编码含495个氨基酸的蛋白，称为p21Ras。RAS蛋白具有GTP/⑶P结合 的能力及GTP酶活性，它们的正常功能为G蛋白类似的调节蛋白，具有从膜结合受体到腺苷酸环化过程的信号传导作用，参与细胞周期的正常调控。目前研究表明，N-ras基因突变在ras基因突变中出现的频率最高，以第12/13或61密码子突变最为常见，ras基因突变与MDS预后的关系密切相关。本发明所开发的NRAS基因突变检测液相芯片涉及的突变位点如下表所示
基因位点__mm__密码子
12-w(野生型)__GGT
G12S (突变型)__AGT
Codonl2G12C (突变型)__TGT
G12D (突变型)__GAT
__G12A (突变型)__GCT
13-w(野生型)__GGT
G13R (突变型)__CGTCodonl3G13D (突变型)__GAT
NRASG13A (突变型)__GCT
__G13V (突变型)__GTT
P」1β 18-w (野生型) GCACodonlS --
__Α18Τ (突变型)__ACA
61-w (野生型)__CAA
Q61K (突变型)__AAA
Codon61Q61L (突变型)__CTA
Q61P (突变型)__CCA
__ Q61R (突变型)CGA目前，对NRAS基因突变进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供NRAS基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单项或者并列检测NRAS基因Codon 12的正常基因型及四种突变型G12S、G12C、G12D、G12A，Codon13的正常基因型及四种突变型G13R、G13D、G13A、G13V，Codonl8的正常基因型及一种突变型A18T，以及Codon 61的正常基因型及四种突变型Q61K、Q61L、Q61P、Q61R。实现上述目的的技术方案如下
一种NRAS基因突变检测液相芯片，包括有(A).针对不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对 Codon 12 位点的 SEQ ID NO. 18 以及 SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQID NO. 21 和 SEQ IDN0. 22 中的一种以上；针对 Codon 13 位点的 SEQ ID NO. 23 以及 SEQ IDNO. 24、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26 和 SEQ ID NO. 27 中的一种以上；针对 Codonl8 位点的 SEQ ID NO. 28 和 SEQ IDN0. 29 ;和 / 或针对 Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 30 以及 SEQ IDNO. 3KSEQ ID NO. 32、SEQ IDN0. 33 和 SEQ ID NO. 34 中的一种以上；所述 tag 序列选自 SEQID NO.1 SEQ ID NO. 17 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 35 SEQ ID NO. 51，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为针对Codon 12,Codon 13、Codonl8位点的SEQ ID NO. 52和 SEQ ID NO. 53 ;和 / 或针对 Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 54 和 SEQ ID NO. 55。优选地，所述ASPE引物为:针对Codon 12位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 18组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 19组成的序列、由SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 20组成的序列、由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 21组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 22组成的序列；针对Codon 13位点的由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 23组成的序列及由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 24组成的序列、由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 25组成的序列、由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 26组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 10和SEQ IDNO. 27组成的序列；针对Codonl8位点的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 28组成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQ IDN0. 29组成的序列；和/或针对Codon 61位点的由SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 30组成的序列及由SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 31组成的序列、由SEQ IDNO. 15和SEQ ID NO. 32组成的序列、由SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 33组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 34组成的序列。本发明的另一目的是提供用于NRAS基因突变检测的特异性引物。实现上述目的的技术方案如下
用于NRAS基因突变检测的特异性引物，其为针对Codon 12位点的SEQ ID NO. 18以及 SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22 中的一种以上；针对Codon 13 位点的 SEQ ID NO. 23 以及 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26 和 SEQID NO. 27中的一种以上；针对Codon18位点的SEQ ID NO. 28和SEQ ID NO. 29中的一种以上；和 / 或针对 Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 30 以及 SEQ ID NO. 3USEQ ID NO. 32,SEQ IDNO. 33和SEQ IDN0. 34中的一种以上。
本发明的主要优点在于1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的NRAS基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，13种突变位点检测可通过一步PCR即可完成2条目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1 NRAS基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对NRAS基因Codon 12的正常基因型及四种突变型G12S、G12C、G12D、G12A，Codon 13的正常基因型及四种突变型G13R、G13D、G13A、G13V，Codonl8的正常基因型及一种突变型A18T，以及Codon 61的正常基因型及四种突变型Q61K、Q61L、Q61P、Q61R，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表I NRAS基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种NRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有(A).针对NRAS基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对 Codon 12 位点的 SEQ ID NO. 18 以及 SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21和SEQ ID NO. 22中的一种以上；针对Codon 13位点的SEQ ID NO. 23以及SEQ ID NO. 24、SEQID NO. 25、SEQ ID NO. 26 和 SEQ ID NO. 27 中的一种以上；针对 Codonl8位点的 SEQ ID NO. 28 和 SEQ IDN0. 29 ;和 / 或针对 Codon 61 位点的 SEQ IDN0. 30 以及 SEQIDN0. 31、SEQ IDN0. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34 中的一种以上；所述 tag 序列选自SEQ ID NO.1 SEQ IDN0. 17 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 35 SEQ ID NO. 51，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的NRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对 Codon 12、Codon 13、Codon 18 位点的 SEQ ID NO. 52 和 SEQ ID NO. 53 ;和 / 或针对Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 54 和 SEQ ID NO. 55。
3.根据权利要求1所述的NRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为针对Codon 12位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 18组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQIDN0. 19组成的序列、由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 20组成的序列、由SEQ ID NO. 4和SEQIDN0. 21组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 22组成的序列；针对Codon 13位点的由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 23组成的序列及由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 24组成的序列、由 SEQ ID NO. 8 和 SEQ ID NO. 25 组成的序列、由 SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 26组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 27组成的序列；针对Codonl8位点的由 SEQ ID NO. 11 和 SEQID NO. 28 组成的序列及由 SEQ ID NO. 12 和 SEQ ID NO. 29 组成的序列；和/或针对Codon 61位点的由SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 30组成的序列及由SEQID NO. 14和SEQ ID NO. 31组成的序列、由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 32组成的序列、由SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 33 组成的序列、和 / 或由 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 34 组成的序列。
4.根据权利要求1所述的NRAS基因突变检测液相芯片，其特征是(A)所述ASPE引物为针对Codon 12位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 18组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 19组成的序列、由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 20组成的序列、由 SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 21 组成的序列、和由 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 22组成的序列；针对Codon 13位点的由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 23组成的序列及由SEQID NO. 7和SEQ IDN0. 24组成的序列、由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 25组成的序列、由SEQID NO. 9和SEQ IDN0. 26组成的序列、和由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 27组成的序列；针对Codonl8位点的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 28组成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQID NO. 29组成的序列；和针对Codon 61位点的由SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 30组成的序列及由 SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 31 组成的序列、由 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 32组成的序列、由SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 33组成的序列、和由SEQ ID NO. 17和SEQ IDNO. 34组成的序列；(B)有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 35 SEQ ID NO. 51，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C)所述扩增引物为:针对Codon 12,Codon 13、Codonl8 位点的 SEQ ID NO. 52 和 SEQID NO. 53 ;和针对 Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 54 和 SEQ ID NO. 55。
5.根据权利要求1-4任一项所述的NRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
6.用于NRAS基因突变检测液的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为针对Codon 12 位点的 SEQ ID NO. 18 以及 SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21 和 SEQID NO. 22 中的一种以上；针对 Codon 13 位点的 SEQ ID NO. 23 以及 SEQ ID NO. 24、SEQ IDNO. 25、SEQ IDN0. 26 和 SEQ ID NO. 27 中的一种以上；针对 Codon 18 位点的 SEQ ID NO. 28和 SEQ ID NO. 29 ;和 / 或针对 Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 30 以及 SEQ ID NO. 31、SEQ IDNO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34 中的一种以上。
全文摘要
本发明公开了一种NRAS基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为针对Codon 12位点的SEQ ID NO.18以及SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.21、和/或SEQ ID NO.22；针对Codon 13位点的SEQ ID NO.23以及SEQID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、和/或SEQ ID NO.27；针对Codon18位点的SEQID NO.28及SEQ ID NO.29；和/或针对Codon 61位点的SEQ ID NO.30以及SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、和/或SEQ ID NO.34；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号C12Q1/68GK102994619SQ20111026977
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者许嘉森, 刘志明 申请人:广州益善生物技术有限公司