专利名称：通用actb基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种操作简单、高特异性和能够定量检测人、大鼠、小鼠等多个物种ACTB (actin，beta)基因表达的DNA体外扩增试剂盒，属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增技术领域。
背景技术：
在现有的DNA体外扩增技术中，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是最主要的也是很有效的常用技木。该技术系将耐热DAN聚合酶、特异引物、dNTPs底物、模板DNA、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温、低温、中温的热循环，以使模板DNA变性、引物与模板复性、引物沿模板DNA延伸反复进行，而达到靶DNA片段在体外呈2n倍扩增(其中n为热循环次数)。荧光定量PCR技术则在PCR反应的基础上，耦合以实时荧光检测和计算机分析技术，即在PCR反应体系中加入能够反映DNA扩增情况的荧光物质，并通过检测经过每个热循环后的荧光变化情况来实时探测DNA的扩增情況，并通过标准曲线对每个反应的起始DNA模板数进行定量測定。TaqMan探针技术是目前最常用的和应用最成功的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一条能够与待扩增检测的靶DNA序列互补配对的寡核苷酸，其5’端标记了ー个突光报告基团(R),其3’端标记了ー个突光淬灭基团(Q)。当这条探针处于游离状态或者没有发生反应时，R所产生的突光将被Q吸收或淬灭；在PCR反应中，该探针可与PCR目标基因发生杂交，并由TaqDNA聚合酶的依赖于聚合的外切活性切断，使得R与Q分离，游离的R发出荧光可被荧光检测装置检测。随着PCR反应的进行，被切断的荧光报告基团(R)与 PCR产物相对应的増加。因此，根据荧光报告基团(R)产生的荧光信号的強弱，即可测量出PCR反应产物的数量。再依据标准曲线即可对每个反应的起始DNA模板数进行定量測定。在荧光定量PCR检测中，经常遇到检测基因相对表达量的情况，其中内对照基因常常选择ACTB。有鉴于此，我们通过大量的实验研究优选出了一套能够有效检测人、大鼠、小鼠等多个物种ACTB基因表达的引物和探针，优化出了其PCR反应的条件，并组装成通用ACTB基因表达检测荧光定量聚合酶链反应试剂盒。
发明内容
本发明的技术方案是首先获得人、大鼠、小鼠的ACTB标准序列，进行BLAST同源性比较，再根据比较结果设计相应的引物和探针，最后将引物、探针加入含有耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板cDNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系中，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；并在中温时检测和记录荧光值。所优选出的引物和探针的序列分别如下上游引物Pl :5’ -AGA TGA CCC AGA TCA TGT TTG-3，(SEQ ID NO 1)；下游引物P2 :5，-CCA CCT CCA GAC GCA GGA T_3’ (SEQ ID NO 2)；TaqMan 探针序列5，-FAM_CAC CCA CAC TGT GCC CATC-TAMRA-3，(SEQ ID NO :3)
所优化出的PCR扩增缓冲反应体系是由引物、探针、耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、PCR缓冲液、超纯水等组成的，各个成分的终浓度分别如下特异的引物和探针每条 0. 25umol/L、Taq DNA 聚合酶1. 5/50ul、dNTPs 底物 0. 3mmol/L、模板 cDNA 若干、Mg++2. 5mmol/L、缓冲液 IXPCR ;其中 IXPCR 缓冲液包括 50mmol/L KClUOmmol/L Tris.HC1PH8. 3、0. 01% 明胶。该ACTB荧光定量PCR由于引物和探针在人、大鼠、小鼠中完全同源，所以能够有效扩增来源于这些物种的ACTB基因，从而检测ACTB基因的表达量。根据上述研究结果，将上述引物、探针和其他PCR试剂混合后分装到PCR扩增管中，并配以 10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML 等系列稀释度的标准 ACTB基因模板组装成通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒。标准ACTB基因模板的序列为5，-AGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGTTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTATGAGGGTTACGCGCTCCCTCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’ (SEQID NO 4)
具体实施例方式1、在DNA合成仪上人工合成下述引物和探针各20D，并用TE缓冲液(其中含lOmmol/LTris, I含10mmol/L EDTA)稀释至10umol/L。其中上游引物Pl序列为5’ -AGA TGA CCCAGA TCA TGT ITG-3’ (SEQ ID NO:1);下游引物 P2 :5’ -CCA CCT CCAGAC GCA GGA T_3’ (SEQ ID NO 2) ;TaqMan 探针序列5’ -FAM-CAC CCA CAC TGT GCCCATC-TAMRA-3’ (SEQID NO 3)2、取各引物、探针各 37. 5ul，25mmol/L dNTPs 18ul，、25mmol/L MgCl2150ul,10XPCR反应缓冲液150ul，5U/ul Taq DNA聚合酶9ul，超纯水990. 5ul加入到2ml的干净无菌试管中，充分混匀，配制1400ul FQ-PCR反应预混液。3、将预混液成按46. 7ul/管分装成30小管(用200ul PCR扩增管)，再配以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀释度的标准ACTB基因模板5管，每管各20ul，即组装成了通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒。其中标准ACTB基因模板的序列为5，-AGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGTTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTATGA GGGTTACGCGCTCCCTCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’ (SEQ ID NO 4)4、FQ-PCR 扩增每个装有46. 7ulPCR反应预混液的反应管中分别加入3. 3ul待测cDNA，水或标准ACTB基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪(如PE9600)中，96°C下变性5分钟，然后按96°C 20秒，53°C 30秒，60°C 30秒热循环45次，并在60°C时检测记录荧光信号；PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于2. 5%琼脂糖凝胶行PCR产物电泳，溴こ锭染色，GelDoclOOO下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的結果。4.结果在30个标本的FQ-PCR反应中，经电泳检测，加入待测标本和标准品的反应产物中均检测到了预期大小的192bp左右的PCR产物条带，而未加DNA标本的阴性对照未见相应扩增产物。加入标准ACTB基因模板和待测标本的反应均获得了 S形的扩增曲线，加入标准ACTB基因模板的Ct值与加入模板拷贝数的对数呈线性关系，可以拟合成一条直线，斜率-3. 35，截 距为41. 3，相关系数9. 9，说明该反应体系和反应条件均符合精确定量研究的要求。
权利要求
1.一种操作简单、能够有效定量扩增检测人、大鼠、小鼠等多个物种的ACTB基因表达的DNA荧光定量体外扩增检测试剂盒；其中包含ACTB特异的引物、探针和耐热DNA聚合酶、 dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系，以及标准 ACTB模板。
2.根据权利要求1所述的通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒，其特征在于 所用引物和探针序列分别为上游引物Pl :5’-AGA TGA CCC AGA TCA TGT TTG-3，(SEQ IDNO 1);下游引物 P2 :5’ -CCA CCT CCA GAC GCA GGA T-3’ (SEQ ID NO 2) ;TaqMan 探针序歹Ij :5’ -FAM-CAC CCA CAC TGT GCC CATC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO :3)。
3.根据权利要求1所述的通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒，其特征在于 特异的引物和探针每条O. 25umol/L、Taq DNA聚合酶1. 5/50ul、dNTPs底物O. 3mmol/L、模板 eDNA 若干、Mg++2. 5mmol/L、缓冲液 IXPCR ;其中 IXPCR 缓冲液包括 50mmol/L KClUOmmol/L Tris. HCl ΡΗ8· 3、0· 01% 明胶。
4.根据权利要求1所述的通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒，其特征在于 标准 ACTB 基因模板序列为5’ -AGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTA GCCATCCAGGCTGTGTTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCAC CCACACTGTGCCCATCTATGA GGGTTACGCGCTCCCTCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’ (SEQ ID NO: 4):其浓度分别为 10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML。
全文摘要
本发明涉及一种能够定量检测人、大鼠、小鼠等多个物种的ACTB基因表达的荧光定量体外扩增检测试剂盒；其中包含ACTB特异的引物、探针和耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系，以及标准ACTB模板；其中所用引物和探针序列分别为上游引物SEQ ID NO 1；下游引物SEQ ID NO 2；探针序列SEQ ID NO 3；引物和探针浓度为每条0.25umol/L、Taq DNA聚合酶1.5U/50ul、dNTPs底物0.3mmol/L、模板cDNA若干、Mg++2.5mmol/L、缓冲液1XPCR；标准ACTB模板序列为SEQ ID NO 4。
文档编号C12Q1/68GK103031362SQ20111029087
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者刘畅 申请人:成都灵动生物技术有限公司