专利名称：一种用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物，可用于对土壤样品中金龟子绿僵菌的分子检测。
背景技术：
金龟子绿僵菌(Metarkizium anisopliae)属真菌门、半知菌类、丛梗菌目、丛梗霉科、绿僵菌属，其寄主范围广、致病力强，是世界上第一个大量生产并用于田间防治的昆虫病原真菌。早在1879年，俄国人MetschnikofT就成功利用金龟子绿僵菌防治奥地利金龟子和甜菜象甲，其后100多年人们在利用绿僵菌控制害虫方面进行了大量的努力。目前，绿僵菌生物制剂已被世界粮农组织(FAO)推荐为环保产品，在非洲和澳洲以及中国大面积推广应用于害虫的生物防治。作为真菌微生物，绿僵菌的防效与其在田间土壤中的存活有很大关系。土壤中绿僵菌的种类与数量检测是评价绿僵菌土壤存活能力的重要内容，传统方法依赖选择性培养基分离培养或大蜡螟诱集法，但是这两种方法耗时费力。随着分子生物学的飞速发展，基于PCR的分子检测技术已在农业微生物研究中应用越来越普遍。PCR技术可对土壤中绿僵菌种类、数量和分布进行有效检测，研究结果将极大地促进该虫生真菌在害虫综合防治体系中的应用。
发明内容
本发明是为了解决目前缺乏引物从土壤样品DNA中扩增出金龟子绿僵菌靶标序列的问题，而提供一种用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物。本发明用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物为正向引物5，-CGGCTGTGCTGGAAAACC A-3，，反向引物 5 ’ -ATTGCGCCCGTCAGTATTCT-3，。将本发明所用弓 I物对命名为qMetF/MetR。本发明的引物是根据真菌核糖体rDNA的序列碱基存在差异的特点而设计的。应用本发明的引物qMetF/MetR可从各类样品DNA中直接扩增出长度为113bp的金龟子绿僵菌目的片段。
图1为实施例1中qMetF/MetR弓丨物对5属6种真菌DNA扩增产物的凝胶电泳图。图2为实施例2中qMetF/MetR弓丨物对土壤样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。
具体实施例方式实施例1分别以金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、黄绿绿僵菌(Metarhiziumflavoviride)> 球抱白僵菌(Beauveria bassiana)、玫烟拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)、尖键抱菌(Fusarium oxysporum)和链格抱菌(Alternaria alternata) 5个属真菌DNA为模板进行引物qMetF/MetR的特异性验证试验。PCR扩增体系为25 μ L由O. 5 μ L DNA模板(约IOng)、0. 5 μ L正向引物qMetF(lOyM)、0· 5 μ L反向引物 qMetR(10 μ L)、0· 5μ L dNTPs (10mmol/L)、2· 5μ L 10XPCRbuffer (with MgC12) ,0. 2μ I TaqDNA 聚合酶(5U/μ L)，灭菌双蒸水补足 25 μ L。PCR 扩增反应条件为预变性94°C 3min，变性94°C 30s，退火58°C 30s，延伸72°C 30s，共35个循环，72 °C延伸5min，4°C保存。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，图1中M泳道为DNA marker BM2000,1-6号泳道分别为含有金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)、黄绿绿僵菌(Metarhizium flavoviride)> 球抱白僵菌(Beauveriabassiana)、玫烟拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、尖键抱菌(Fusarium oxysporum)和链格孢菌(Alternaria alternata)DNA的扩增结果,7号泳道为不含DNA空白对照的扩增结果。从图1中可以看出本实施方式用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物qMetF/MetR能够准确的扩增出金龟子绿僵菌的靶标序列片段，而未能从近缘真菌DNA和空白对照中扩增出核酸片段。将I号泳道对应的序列片段与T载体连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞测序，测序结果为序列长度为113bp,并且经blast分析,为金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)的特异序列。实施例2应用引物qMetF/MetR对5份土样(采自河北廊坊市)DNA进行PCR扩增试验。PCR扩增体系为:25yL 由 0.5yL DNA 模板(约 IOng)、0· 5 μ L 正向引物 qMetF(10 μ Μ)、0· 5 μ L反向引物 qMetR(10yM)、0.5yL dNTPs (10mmol/L)、2· 5 μ L 10XPCR buffer (with MgCl2)、0. 2μ I TaqDNA聚合酶(5U/ μ L)，灭菌双蒸水补足25 μ LICR扩增反应条件为预变性94°C3min，变性 94°C 30s，退火 58°C 30s，延伸 72°C 30s，共 35 个循环，72°C延伸 5min，4°C保存。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，图2中M泳道为DNA marker BM2000,1-5号泳道分别为河北廊坊市土壤样品DNA的扩增结果，6号泳道为不含DNA空白对照的扩增结果。从图2中可以看出本实施方式用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物qMetF/MetR能够准确的从所有土壤样品DNA中扩增出金龟子绿僵菌的靶标序列片段。随机挑选I和3号泳道对应的序列片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞测序，测序结果为序列长度为113bp，并且经blast分析，为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的特异序列。
序列表核苷酸序列表
<110>谢明
<120> 一种用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> I<211> 19<212> DNA
<213> Metarhizium anisopliae<400> I
cggctgtgct ggaaaacca19
<210> 2<211> 20<212> DNA
<213〉Metarhizium anisopliae<400> 2
attgcgcccg tcagtattct 20
权利要求
1.一种用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物，其特征在于用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物为正向引物 qMetF :5’ -CGGCTGTGCTGGAAAACCA-3’反向引物 qMetR :5’ -ATTGCGCCCGTCAGTATTCT-3’。
全文摘要
一种用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物，它涉及一对用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物。本发明解决了目前缺乏引物从土壤样品DNA中扩增出金龟子绿僵菌靶标序列的问题。本发明用于扩增金龟子绿僵菌的特异性引物为qMetF(5’-CGGCTGTGCTGGAAAACCA-3’)和qMetR(5’-ATTGCGCCCGTCAGTATTCT-3’)。本发明的引物能够准确扩增出金龟子绿僵菌目的片段。
文档编号C12N15/11GK103045587SQ20111031059
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者谢明, 张艳军 申请人:谢明