专利名称：肠道病毒71型单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒免疫生物医学领域，具体地说，涉及一种肠道病毒71型单克隆抗体及其应用。
背景技术：
手足口病(Hand，foot and mouth diseases，HFMD)是一种全球范围内广泛流行的粪口传播的疾病，世界上大部分地区均有此病流行的报导。长期以来，轻度的手足口病在世界范围内周期性爆发。该病于1957年在新西兰首次报道，1958年首次分离出柯萨奇病毒， 1959年提出手足口病的名称。1969年美国从中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出肠道病毒71 (EV71病毒)，该病毒被首次确认。手足口病流行的间隔期为2-3年，早期的病原体以Cox A16型为主，后来EV71与Cox A16交替出现，成为手足口病的主要病原体。20 世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行。1994年英国暴发了 Cox A16引起的手足口病。20世纪90年代后期，EV71在亚太地区的流行呈逐年上升趋势，由此引起的手足口病在东南亚地区广泛流行，感染后常导致患者发生严重的中枢神经系统症状，死亡率较高。 1997年马来西亚爆发主要由EV71引起的手足口病，4-6月间共四例病人死亡。1998-2001 年手足口病在新加坡大量流行。在我国，1981年上海首次报道HFMD ；此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等十几个省市均有该病的报道。1983年天津暴发了 Cox A16引起的手足口病，5-10月间发生了 7，000余病例；经过2年低水平散发后，1986年再次暴发。1995年武汉病毒研究所从手足口病病人中分离出EV71病毒，1998年深圳市卫生防疫站从患者标本中分离出EV71病毒。1998年台湾暴发了大规模的EV71疫情，发病人数估计达150万，其中重症405例，死亡78例，大多为5岁以下的幼儿。我国2000年80，677 人感染HFMD，重症感染者例，死亡41例；2001年出现389例重症感染者，55人死亡。手足口病已经越来越成为威胁国内儿童健康的广泛流行性疾病之一。2007年至今，该病在我国不断流行；山东临沂、青岛和济南、安徽阜阳等地均发生以EV71为主要病原体导致的手足口病的流行。HFMD为自限性疾病，在婴幼儿中传播，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等致死性并发症。EV71与Cox A16是导致HFMD的两种最主要的病原体；其中EV71占HFMD重症病例的90%左右，占死亡病例的 80%左右。EV71属于微小核糖核酸病毒科肠道病毒属，为单股正链RNA，含7000多个核苷酸，包括一个开放阅读框，编码VP1-VP4四个病毒结构蛋白。VPl是主要的衣壳蛋白与病毒中和决定因子，具有最多的型特异性中和位点，负责病毒与靶细胞的结合，决定着病毒的抗原性，其基因序列与病毒血清型具有较高的相关性，根据VPl的全基因序列，将EV71分为A、 B和C型3个基因型。目前用于检测EV71病毒的方法主要有RT-PCR法和荧光定量PCR法。上述方法特异性较好，但是灵敏度差，试验容易发生污染出现假阳性和假阴性结果。同时病毒在传播过程中存在一定核苷酸突变的几率，因此引物设计是个问题。同时试验费用高，需要许多大型仪器设备和熟练的技术人员，操作复杂，检测时间长，不易在我国推广使用。疫苗作为疾病的有效预防手段，其有效性得到了世界公认。但是疫苗生产过程中病毒需经过灭活、纯化去除杂质等一系列步骤，其有效成分的检测是指导疫苗研发与成败的关键点。检测病毒抗原常采用ELISA法，该方法以灵敏性度高和特异性好的特点在很多病毒检测中发挥重要作用。EV71抗原ELISA检测关键是有特异性好的抗EV71抗体，以保证检测试剂的特异性，同时抗体需要有稳定来源具有稳定的细胞株，并且抗体需要高效价、高中和活性，以确保检测的抗原为活性表位抗原。同样，对于EV71感染的早期发现，EB71流行病学调查来说，EV71抗体检测也存在上述类似问题。因此为了抑制病毒的传播扩散，进行疾病监测，病毒的鉴别试验，以及疫苗研制过程中病毒抗原表位的检测，有必要开发针对 EV71病毒的具有广泛高度活性与中和活性的单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述背景技术上的问题，制备一种抗EV71的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。发明人采用EV71灭活病毒作为抗原利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，然后通过间接ELISA法筛选单抗细胞株，并对筛选的单克隆抗体进行中和试验，获得了能分泌中和 EV71病毒A、B、C三种基因型的可特异性结合EV71病毒的细胞系，以及由所属细胞系产生的单克隆抗体。为了实现本发明目的，本发明一方面提供了一种对EV71病毒各基因型均有较高反应性和中和活性的杂交瘤细胞株。其制备方法是采用常规技术将源自于EV71纯化液免疫接种的鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，选择产生抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞。对于本发明的上述杂交瘤细胞株，申请人于2011年10月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)对其进行了保藏，保藏号为CGMCC No. 5330(对应的本发明的编号为A9)。本发明的另一方面提供了由上述杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体。进一步的，本发明的抗体可根据其抗原结合区域(例如重链和轻链可变区)发展出的各种衍生抗体，可以用于被动免疫治疗或预防EV71病毒感染，优选人源化抗体。更进一步的，本发明提供了一种用于治疗和/或预防EV71感染的方法，其中包括将本发明所述的单克隆抗体。再进一步的，本发明还提供了上述单克隆抗体在制备检测EV71病毒三基因型的抗原的试剂、药剂或试剂盒中的应用。本发明的再一方面，提供了用于检测EV71病毒的试剂、药剂或试剂盒，其包括本发明所述的单克隆抗体。所述试剂、药剂或试剂盒用于检测EV71病毒抗原，从而进一步用于诊断EV71病毒感染。本发明的再一方面，还提供了用于检测EV71抗体的试剂、药剂或试剂盒，其包括本发明所述的单克隆抗体。所述试剂、药剂或试剂盒用于检测抗EV71病毒IgG、IgM抗体， 从而进一步用于诊断EV71病毒感染。所述EV71病毒选自A、B、C三种基因型的EV71病毒，优选地，本发明所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型 EV71病毒。进一步的，所述试剂、药剂或试剂盒优选包括标记的本发明的单克隆抗体。所述的标记，其是指生物标记或化学标记，优选荧光标记、放射性标记或酶标记，更优选辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记或荧光素标记。本发明的又一方面提供了一种用于治疗和/或预防EV71感染的药物，其包括上述的单克隆抗体。所述药物优选为进一步包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。本发明的又一方面提供了一种用于治疗和/或预防EV71感染的疫苗，其包括上述的单克隆抗体。本发明的又一方面提供了一种治疗和/或预防EV71感染的方法，其中包括将本发明所述的单克隆抗体施用于患者。本发明的还一方面提供了用于检测EV71抗原的方法，其中使用了本发明所述的单克隆抗体，或标记的本发明的单克隆抗体。优选的，采用双抗体夹心法进行检测EV71抗原。进一步的，该方法包括1、用于样本中针对EV71的IgG抗体的检测方法。采用竞争阻断ELISA的方法，通过包被EV71抗原，然后加入待检测血清或者其他样本以及酶标记的抗EV71单克隆抗体，样本中的抗体与酶标记抗体竞争结合包被抗原，可用于检测样本中的IgG含量。2、用于样本中针对EV71的IgM抗体的检测方法。通过包被抗μ蛋白，然后加入待检样品，样品中的IgM与抗μ蛋白蛋白结合，然后加入EV71抗原与酶标记的抗EV71 单克隆抗体，则可特异性的检测样本中的IgM。本发明采用上述单克隆抗体所开发的实验技术与试剂可用于EV71的临床研究与流行病学研究，尤其适用于区分与EV71病毒高度同源的手足口病的另一主要致病病毒Cox A16。本发明提供的单克隆抗体及其相关试剂对于推动我国EV71病毒所致的重症与死亡病例的治疗与研究有重要意义，对进一步推进EV71的临床、流行病学发展以及被动治疗具有极其重要的价值，对于EV71病毒的结构研究、致病机理研究以及其他基础研究具有重要作用。根据以上描述，本发明具有如下优点或可应用的方面。1、本发明的抗EV71病毒的A9单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型均具有较高的间接法效价，即反应性。2、本发明的A9单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型均具有较高的中和效价， 中和活性较高。3、本发明的A9单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型均具有中和活性，说明 EV71病毒A、B、C三基因型具有相同的表位。4、本发明的A9单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型均有较高的反应性与中和活性，提示该单克隆抗体可广泛用于EV71病毒检测、鉴别、筛查与疫苗生产的抗原检测，同时检测的是病毒的抗原决定簇，可以更加有效的反映疫苗的有效组分，对疫苗的工艺研究与生产具有较强的指导意义。5、本发明的A9单克隆抗体对应的是EV71病毒的中和表位，可用于抗EV71 IgG抗体竞争法检测，用于疫苗免疫效果的评价以及流行病学调查，更加有效的评价疫苗的免疫效果以及地区的过往发病史。6、本发明的A9单克隆抗体对应的是EV71病毒的中和表位，可用于抗EV71 IgM抗体检测，用于疫苗免疫效果以及急性期流行发病的研究，更加有效的评价急性期EV71的发病情况调查。7、本发明的A9单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型均有较强的中和效果，该单克隆抗体的序列结构以及对单克隆抗体本身的人源化改造成，针对EV71病毒的广谱的治疗性具有重要的理论意义和实用价值。8、本发明的A9单克隆抗体对于与EV71病毒高度同源的CoxA16无交叉反应，A9单克隆抗体是针对EV71的特异性单抗。9、本发明的A9单克隆抗体对天然构象的病毒具有结合性和中和性，可用于EV71 病毒的结构研究。10、本发明的A9单克隆抗体对天然构象的病毒具有结合性和中和性，可用于EV71 发病机理、致病性的研究，并由此开发针对EV71的治疗、干扰药物。11、本发明的A9单克隆抗体较之前申请的HD6单抗具有更高的间接法活性、中和活性，同时不针对同一抗原表位，而且抗体的产量更高，作为各类诊断、检测试剂的原料，成本更低。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1抗EV71单克隆抗体细胞株的建立1、免疫原制备免疫原为EV71灭活病毒(该病毒于2009年5月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No. 3062)接种Vero 细胞，经培养、灭活、纯化制得。2、动物免疫取EV71灭活病毒免疫BALB/c小鼠。首次采用弗氏完全佐剂与EV71 混合乳化按照本领域公知的方法免疫动物；10天后采用弗氏不完全佐剂与EV71混合乳化加强免疫小鼠；一周后采用间接ELISA法测定血清抗EV71活性。对抗体效价最高的小鼠用 EV71纯化液腹腔加强免疫。3、细胞融合建株末次加强免疫3天后，无菌取小鼠脾脏，收集细胞用无血清培养液洗3次。收获对数生长期的SP2/0骨髓瘤计数。然后按比例进行骨髓瘤细胞与脾细胞融合，用HAT选择培养基培养杂交瘤细胞，第七天采用间接ELISA法检测细胞上清筛选阳性细胞孔。将A、B、C三种基因型病毒纯化液分别包被酶标板，加入待检样品反应后加入HRP标记的抗小鼠二抗，筛选同时呈阳性的细胞孔。间接ELISA试验方法法如下将A、B、C三基因型EV71病毒纯化液采用0. OlM PBS 1 100稀释后100 μ 1/孔包被酶标板，2_8°C过夜后， 加入阴性血清对照与待检血清，同时并设置空白对照孔，37°C反应1小时后洗涤酶标板，加入1 8000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP ；37°C反应后洗板，加入TMB显色液后终止读数。采用有限稀释法对上述阳性细胞孔进行两次克隆化。每次克隆后七天采用上述方法间接ELISA法检测克隆板内的细胞上清抗体效价，选择抗体效价较高的单细胞阳性孔扩
6大培养并冻存，获得A9单克隆细胞株。实施例2单克隆抗体的制备将BALB/c小鼠腹腔免疫石蜡。培养杂交瘤细胞，收集后离心洗涤1次，重悬于无血清培养液中，调整细胞密度，腹腔注射致敏7天的小鼠。接种7-12天左右后小鼠腹腔明显胀大，用注射器收集腹水，1500rpm离心10分钟收集腹水，对单克隆抗体细胞株建株，液氮保存。实施例3单克隆抗体的特异性测定采用经过硫酸铵纯化后的A9单抗包被酶标板，加入A、B、C三种基因型的EV71灭活液、Cox A16病毒、甲肝病毒、乙脑病毒、水痘病毒等，用HRP标记的兔抗EV71多抗为标记抗体，进行抗原检测。结果显示，仅EV71病毒反应，单抗与其他肠道病毒以及其他手足口病毒如Cox A16无交叉反应，特异性较好。实施例4单克隆抗体免疫球蛋白类型及其亚类测定采用市售小鼠单抗Ig类/亚类检定用酶联免疫试剂盒，检测A9单克隆抗体的类型及其亚类。将A9单克隆抗体细胞株培养的细胞上清加样于酶标板，反应后经洗板加入可区分IgGl/IgGh/IgG2b/IgG3/IgM/IgA的HRP酶标记抗体，反应后显色，分析数据。结果为 A9单克隆抗体为IgG 2b亚型。实施例5A9单抗与HD6单抗的分析北京科兴生物制品有限公司于2009年3月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)对抗EV71单克隆抗体细胞株HD6进行了保藏，保藏号为CGMCC No.四37。将A9与HD6两株抗EV71单克隆抗体进行对比研究。抗体效价采用间接ELISA检测A9和HD6单克隆抗体的抗体效价。EV71纯化液采用0.01M PBS 1 100稀释后100μ 1/孔加于酶标板，2-8°C包被过夜后洗板封闭，检测单克隆抗体的效价，同时做阴性血清对照。样品均采用含10%小牛血清的0. OlM PBSWl 100 起始10倍梯度系列稀释，100 μ 1/孔加样与包被后的酶标板，37°C反应60分钟，然后洗板加入HRP标记的羊抗小鼠二抗100 μ 1/孔，37°C反应后洗板、显色、终止并读数。结果如下表1抗体效价检测结果
稀释倍数IO2IO3IO4IO5IO6IO7阴性对照0. 0420. 0260. 0340. 0240. 0340. 030A93. 0663. 1793. 2443. 0551. 4850. 524HD63. 1263. 1043. 1542. 8200. 8280. 202结果可见，A9株单克隆抗体的间接ELISA效价在IO7时，高于HD6的效价，HD6在稀释IO7时的反应活性约为A9相应稀释度活性的37%左右。竞争阻断试验EV71纯化液采用0. OlM PBS 1 50稀释，100 μ 1/孔加于酶标板， 2-8°C包被过夜后洗板封闭。将抗EV71单克隆抗体A9、HD6、HC1单抗采用含10%小牛血清的0.01M PBSWl 500起始4倍梯度系列稀释，50 μ 1/孔加样，然后加入1 300稀释的 HD6-HRP 50 μ 1/孔，37°C反应60分钟后洗板、显色、终止后读数。结果如下
7
表2抗EV71单克隆抗体与HD6单抗竞争阻断试验结果
权利要求
1.一种EV71病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No. 5330。
2.—种权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。
3.一种用于检测EV71病毒的试剂、药剂或试剂盒，其包括权利要求2所述的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的试剂、药剂或试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体是生物标记或化学标记的。
5.如权利要求4所述的试剂、药剂或试剂盒，其特征在于，所述生物标记或化学标记为荧光标记、放射性标记或酶标记。
6.一种用于治疗和/或预防EV71感染的药物，其包括权利要求2所述的单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
8.一种用于治疗和/或预防EV71感染的疫苗，其包括权利要求2所述的单克隆抗体。
9.一种检测EV71抗原或抗体的方法，其包括权利要求2-5所述的单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了一种肠道病毒71型单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体来源于EV71病毒杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.5330。本发明的单克隆抗体及其相关试剂对于推动我国EV71病毒所致的重症与死亡病例的治疗与研究有重要意义，对进一步推进EV71的临床研究、流行病学发展以及被动治疗具有极其重要的价值。
文档编号C12R1/91GK102409028SQ20111034399
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者尹卫东, 张立志, 王琳, 蔡芳, 薛晨宝, 高强 申请人:北京科兴生物制品有限公司