一种产耐高温α-淀粉酶菌种的优化方法

专利名称：一种产耐高温α-淀粉酶菌种的优化方法
技术领域：
本发明属于产酶菌种领域，具体涉及一种产耐高温α -淀粉酶-地衣芽孢杆菌 10181的优化方法。
背景技术：
耐高温α -淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中，是一种内切葡萄糖苷酶，是目前最重要的工业酶制剂之一。目前生产耐高温α-淀粉酶使用最为广泛的是细菌，尤其是杆菌(如解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)。耐高温α-淀粉酶以其优良的特性的特性广泛应用于造纸、纺织、印染、柠檬酸、乳酸发酵、啤酒、酒精、味精、糖等工业领域，用量大，市场占有率高，应用前景非常广泛。耐高温α -淀粉酶能在较高的温度下迅速水解淀粉分子中的α _1，4葡萄糖苷键， 任意切割凝胶淀粉成长短不一的短链糊精和少量的低聚糖、葡萄糖和麦芽糖，从而使淀粉糊的粘度迅速下降。地衣芽孢杆菌10181为芽孢杆菌科细菌，革兰氏阳性杆菌，细胞大小为0. SumX (1. 5 3. 5) μπι，细胞形态和排列呈杆状、单生，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大， 在淀粉平板培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为 3mm，周围有明显的淀粉水解圈，有动力。地衣芽孢杆菌CICC 10181是由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，中国工业微生物菌种保藏管理中心负责全国工业生产与研究应用微生物菌种的收集、保藏与供应，微生物菌种保藏技术的研究与培训等，也是国际菌种保藏联合会(WFCC)和中国微生物菌种保藏管理委员会成员之一。随着社会的发展，越来越要求酶活力高，添加量少的酶制剂产品，而现在一般的生产厂家生产的耐高温α-淀粉酶制剂的发酵液酶活力低，后处理工序复杂、生产成本相对较高。为了降低生产成本并满足市场的要求，需要开发或者优化出一株产酶活力高的菌株。

发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种产耐高温α -淀粉酶-地衣芽孢杆菌10181的优化方法。本发明是通过下述的技术方案来实现的
一种产耐高温α -淀粉酶菌种的优化方法，包括下述的步骤 a.菌种的活化培养将冷冻管保存的地衣芽孢杆菌10181菌种拿出活化，活化培养基牛肉膏0. 5 0. 7%、蛋白胨1. 0 1. 2%、氯化钠0. 3 0. 5%、琼脂1. 5 2. 0%、余量为水， 加热以上的组份至其溶解，调PH在6. 8 7. 2之间，装瓶包扎，在0. IMpa下加热到120°C 122°C灭菌20 30min，冷却到15 50°C在无菌条件下倒平板或摆斜面，备用；由冷冻管菌种划线接种于平板培养基，27°C 30°C，培养1 2天；挑取单菌落36 40°C，培养1 2 天，保存备用；b.菌种的优化将保存的菌种划线于淀粉平板培养基上蛋白胨1 2%，酵母粉 0. 1 0. 5%、牛肉粉0. 3 0. 7%、玉米淀粉0. 5 1. 8%、葡萄糖0. 2 0. 4%、琼脂1. 5 2. 0%、余量为水，调pH6. 5 7. 0，在121°C下灭菌20 30min，36°C 42°C培养1 1. 5天， 选出淀粉水解圈大的单菌落，来进行种子扩培；
c.菌种的扩培玉米淀粉5 10%，豆饼粉1 4%，硫酸铵0.5 1%，氯化钙0. 02 0. 05%，磷酸氢二钾1. 3 2%，磷酸二氢钾1. 3 2%，消泡剂0. 02 0. 05%、余量为水，调 PH6.5 7.0，在121°C下灭菌40 min，将液体摇瓶种子液接入种子罐培养基中，接种量为 1 3%，36°C 42°C培养1 1. 5天；
d.发酵后提取发酵结束后，发酵液脱色、经过板框过滤后，再经过超滤循环，制得液体酶制剂；脱色投料比为发酵液活性炭=90 100 :1，搅拌转速60 SOrpm，脱色时间 1 1.证；板框进料待出滤液后，先启动滤液上料泵打回流，滤液澄清后，打开袋式过滤器前的进料阀门，关闭回流阀，将滤液打往超滤循环罐；超滤浓缩工序清洗3 4bar条件下内循环10分钟，超滤压力稳定4 ^ar。优选的，一种产耐高温α -淀粉酶菌种的优化方法，包括下述的步骤
a.菌种的活化培养
平板培养基的配方牛肉膏0. 7%，蛋白胨1. 2%，氯化钠0. 5%，琼脂1. 8 %，余量为水，加热以上的组份使其溶解，调PH在7. 2，装瓶包扎，在0. IMpa下加热到121°C灭菌30min，冷却到45°C在无菌条件下倒平板或摆斜面，备用；
接种与培养由冷冻管菌种划线接种于平板培养基，38°C，培养30h ；挑取单菌落接种于斜面培养基上，38°C，培养30h，保存备用；
b.菌种的优化
淀粉平板培养基的配方蛋白胨2%、酵母粉0. 5%、牛肉粉0. 7%、玉米淀粉1. 8%、葡萄糖 0. 4% (单灭)、琼脂1. 8%、余量为水，调pH为7. 0，121°C下灭菌30分钟，无菌室中倒平板， 冷却备用；
优化与培养将保存的菌种划线于淀粉平板培养基上，38°C培养30h，选出淀粉水解圈大的单菌落，来进行种子扩培；
c.菌种的扩培
种子培养基配方玉米淀粉10%、豆饼粉4%、硫酸铵1%、氯化钙0. 05%、磷酸氢二钾2%、 磷酸二氢钾2%、消泡剂0. 05%、余量为水，调pH7. 0，在121 °C下灭菌时间40min，降温到 36 0C -42°C，备用；
种子的扩培将液体摇瓶种子液接入种子罐培养基中，接种量2. 5%, 38°C通风搅拌培养40h，接入发酵罐中；
d.发酵后提取
发酵结束后，发酵液脱色、经过板框过滤后，再经过超滤循环，制得液体酶制剂；脱色投料比发酵液活性炭=90:1，搅拌转速80 rpm，脱色时间1. 5小时；板框进料待出液后， 先启动滤液上料泵打回流，滤液澄清后，打开袋式过滤器前的进料阀门，关闭回流阀，将滤液打往超滤循环罐；
超滤浓缩工序清洗4bar条件下内循环10分钟，超滤压力稳定恥虹。本发明的有益效果在于，采用本发明的优化方法对产耐高温α -淀粉酶-地衣芽孢杆菌10181的进行优化，该菌种所产的耐高温α -淀粉酶其酶活达到llOOOu/ml，耐受温度高达110°C，而采用现有方法生产的耐高温α-淀粉酶其酶活一般在2500u/ml，耐受温度为95°C，无论是从酶活还是从对温度的耐受能力上看，都要优于现有方法生产的α-淀粉酶，因此，本发明的优化方法对产耐高温α -淀粉酶-地衣芽孢杆菌10181进行优化，生产的酶其酶活力高，而且耐受高温，大大的降低了酶的生产成本。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。实施例1
a.地衣芽孢杆菌10181的活化培养
平板培养基的配方牛肉膏0. 5%，蛋白胨1. 0%，氯化钠0. 3%，琼脂1. 8 %、余量为水，加热溶解，调PH 6. 8，装瓶包扎，在0. IMI^a加热到121°C灭菌20min，冷却到45_50°C无菌条件下倒平板或摆斜面，备用；
接种与培养由冷冻管菌种划线接种于平板培养基，36°C，培养40h ；挑取单菌落接种于斜面培养基上，36°C，培养40h，保存备用；
b.地衣芽孢杆菌10181的优化
淀粉平板培养基的配方蛋白胨1%、酵母粉0. 1%、牛肉粉0. 3%、玉米淀粉0. 8%、葡萄糖 0. 2% (单灭)、琼脂1. 5%、余量为水，调ρΗ6· 7，在121°C灭菌20分钟，无菌室中倒平板，冷却
优化与培养将保存的菌种划线于淀粉平板培养基上，36°C培养40h，选出淀粉水解圈大的单菌落，来进行种子扩培；
c.地衣芽孢杆菌10181的扩培
种子培养基配方玉米淀粉5%，豆饼粉2%，硫酸铵0. 5%，氯化钙0. 02%,磷酸氢二钾 1. 3%，磷酸二氢钾1. 3%，消泡剂0. 02%、余量为水，调ρΗ6· 5，在121°C灭菌40分钟，降温到 38°C，备用；
种子的扩培将液体摇瓶种子液接入种子罐培养基中，接种量1%，36°C通风搅拌培养 45h，接入发酵罐中；
d.发酵后提取发酵结束后，发酵液脱色、经过板框过滤后，再经过超滤循环，制得液体酶制剂；脱色投料比发酵液活性炭=100 :1，搅拌转速60rpm，脱色时间1小时；板框进料待出液后，先启动滤液上料泵打回流，滤液澄清后，打开袋式过滤器前的进料阀门，关闭回流阀，将滤液打往超滤循环罐；
超滤浓缩工序清洗Jbar条件下内循环10分钟，超滤压力稳定4bar。耐高温α -淀粉酶酶活力检测根据GB 8275-2009《食品添加剂α -淀粉酶制剂》， 酶活力达到11200u/ml，耐受温度高达110°C。实施例2
a.地衣芽孢杆菌10181的活化培养
平板培养基的配方牛肉膏0. 7%，蛋白胨1. 2%，氯化钠0. 5%，琼脂1. 8%、余量为水，加热溶解，调PH在7. 2，装瓶包扎，在0. IMpa下加热到121°C灭菌30min，冷却到48°C无菌条件下倒平板或摆斜面，备用；
接种与培养由冷冻管菌种划线接种于平板培养基，38°C，培养30h ；挑取单菌落接种于斜面培养基上，38°C，培养30h，保存备用；
b.地衣芽孢杆菌10181的优化
淀粉平板培养基的配方蛋白胨2%，酵母粉0. 5%、牛肉粉0. 7%、玉米淀粉1. 8%、葡萄糖 0. 4% (单灭)、琼脂1. 8%、余量为水，调pH 7. 0，在121°C下灭菌30分钟，无菌室中倒平板，冷却备用；
优化与培养将保存的菌种划线于淀粉平板培养基上，38°C培养30h，选出淀粉水解圈大的单菌落，来进行种子扩培；
c.地衣芽孢杆菌10181的扩培
种子培养基配方玉米淀粉10%，豆饼粉4%，硫酸铵1%，氯化钙0. 05%,磷酸氢二钾2%， 磷酸二氢钾2%，消泡剂0. 05%、余量为水，调pH7. 0，在121°C下灭菌40分钟，降温到38°C，备用；
种子的扩培将液体摇瓶种子液接入种子罐培养基中，接种量2. 5%，42°C通风搅拌培养40h，接入发酵罐中；
d.发酵后提取
发酵结束后，发酵液脱色、经过板框过滤后，再经过超滤循环，制得液体酶制剂；脱色投料比发酵液活性炭=90:1，搅拌转速80 rpm，脱色时间1. 5小时；板框进料待出液后， 先启动滤液上料泵打回流，滤液澄清后，打开袋式过滤器前的进料阀门，关闭回流阀，将滤液打往超滤循环罐；
超滤浓缩工序清洗4bar条件下内循环10分钟，超滤压力稳定恥虹。耐高温α -淀粉酶酶活力检测根据GB 8275-2009《食品添加剂α -淀粉酶制剂》， 酶活力达到11400u/ml，耐受温度高达110°C。实施例3
a.地衣芽孢杆菌10181的活化培养
平板培养基的配方牛肉膏0. 7%，蛋白胨1. 2%，氯化钠0. 5%，琼脂1. 8%、余量为水，加热溶解，调PH在8. 0，装瓶包扎，在0. IMpa下加热到121°C灭菌30min，冷却到48°C无菌条件下倒平板或摆斜面，备用；
接种与培养由冷冻管菌种划线接种于平板培养基，38°C，培养30h ；挑取单菌落接种于斜面培养基上，38°C，培养30h，保存备用；
b.地衣芽孢杆菌10181的优化
淀粉平板培养基的配方蛋白胨2%，酵母粉0. 5%、牛肉粉0. 7%、玉米淀粉1. 8%、葡萄糖 0. 4% (单灭)、琼脂1. 8%、余量为水，调pH 8. 0，在121°C下灭菌30分钟，无菌室中倒平板，冷却备用；
优化与培养将保存的菌种划线于淀粉平板培养基上，38°C培养30h，选出淀粉水解圈大的单菌落，来进行种子扩培；
c.地衣芽孢杆菌10181的扩培
种子培养基配方玉米淀粉10%，豆饼粉4%，硫酸铵1%，氯化钙0. 05%，磷酸氢二钾2%， 磷酸二氢钾2%，消泡剂0. 05%、余量为水，调pH8. 0，在121°C下灭菌40分钟，降温到38°C，备用；
种子的扩培将液体摇瓶种子液接入种子罐培养基中，接种量2. 5%，38°C通风搅拌培养40h，接入发酵罐中； d.发酵后提取
发酵结束后，发酵液脱色、经过板框过滤后，再经过超滤循环，制得液体酶制剂；脱色投料比发酵液活性炭=90:1，搅拌转速80 rpm，脱色时间1. 5小时；板框进料待出液后， 先启动滤液上料泵打回流，滤液澄清后，打开袋式过滤器前的进料阀门，关闭回流阀，将滤液打往超滤循环罐；
超滤浓缩工序清洗4bar条件下内循环10分钟，超滤压力稳定恥虹。耐高温α -淀粉酶酶活力检测根据GB 8275-2009《食品添加剂α -淀粉酶制剂》， 酶活力达到5000u/ml，耐受温度高达90°C。实施例4
a.地衣芽孢杆菌10181的活化培养
平板培养基的配方牛肉膏0. 2%、蛋白胨0. 5%、氯化钠0. 1%、琼脂1. 5%、余量为水，加热以上的组份至其溶解，调PH在6. 5之间，装瓶包扎，在0. IMpa下加热到120°C 122°C灭菌 20 30min，冷却到15 50°C在无菌条件下倒平板，备用；
优化与培养由冷冻管菌种划线接种于平板培养基，27°C 30°C，培养1 2天；挑取单菌落36 40°C，培养1 2天，保存备用； b.地衣芽孢杆菌10181的优化
淀粉平板培养基的配方蛋白胨0. 5%，酵母粉0. 1%、牛肉粉0. 1%、玉米淀粉0. 4 %、琼脂 1. 5%、余量为水，调pH6. 5，在121°C下灭菌20 30min,
优化与培养将保存的菌种划线于淀粉平板培养基上，36°C 42°C°C培养30h，选出淀粉水解圈大的单菌落，来进行种子扩培；
c.地衣芽孢杆菌10181的扩培
种子培养基配方玉米淀粉4%，豆饼粉1%，硫酸铵0. 1%，磷酸氢二钾0. 5%，磷酸二氢钾 0. 5%，消泡剂0.05%、余量为水，调pH6. 5，在121°C下灭菌40 min ；
种子的扩培将液体摇瓶种子液接入种子罐培养基中，接种量2. 5%，38°C通风搅拌培养40h，接入发酵罐中；
d.发酵后提取发酵结束后，发酵液脱色、经过板框过滤后，再经过超滤循环，制得液体酶制剂；脱色投料比为发酵液活性炭=100 :1，搅拌转速40rpm，脱色时间0. 5h ；板框进料待出滤液后，先启动滤液上料泵打回流，滤液澄清后，打开袋式过滤器前的进料阀门， 关闭回流阀，将滤液打往超滤循环罐；
超滤浓缩工序清洗Jbar条件下内循环10分钟，超滤压力稳定2bar。耐高温α -淀粉酶酶活力检测根据GB 8275-2009《食品添加剂α -淀粉酶制剂》， 酶活力达到2500u/ml，耐受温度高达90°C。但是酶液后提取时间长，超滤较慢，颜色较深。
权利要求
1.一种产耐高温α-淀粉酶菌种的优化方法，包括下述的步骤a.菌种的活化培养将冷冻管保存的地衣芽孢杆菌10181菌种拿出活化，活化培养基牛肉膏0. 3 1. 0%、蛋白胨0. 7 1. 5%、氯化钠0. 1 0. 8%、琼脂1. 5 2. 0%、余量为水， 加热以上的组份至其溶解，调PH在6. 5 7. 5之间，装瓶包扎，在0. IMpa下加热到120°C 122°C灭菌20 30min，冷却到15 50°C在无菌条件下倒平板或摆斜面，备用；由冷冻管菌种划线接种于平板培养基，27°C 30°C，培养1 2天；挑取单菌落36 40°C，培养1 2 天，保存备用；b.菌种的优化将保存的菌种划线于淀粉平板培养基上蛋白胨1 洲，酵母粉0.1 0. 8%、牛肉粉0. 1 0. 8%、玉米淀粉0. 5 1. 8%、葡萄糖0. 1 0. 5%、琼月旨1. 5 2. 0%、余量为水，调PH6. 5 7. 5，在121°C下灭菌20 30min，36°C 42°C培养1 1. 5天，选出淀粉水解圈大的单菌落，来进行种子扩培；c.菌种的扩培玉米淀粉5 10%，豆饼粉1 4%，硫酸铵0.1 1%，氯化钙0. 02 0. 08%，磷酸氢二钾1 2%，磷酸二氢钾1 2%，消泡剂0. 02 0. 08%、余量为水，调pH6. 5 7.5，在1211下灭菌40 min，将液体摇瓶种子液接入种子罐培养基中，接种量为1 5%， 36°C 42°C培养1 2天；d.发酵后提取发酵结束后，发酵液脱色、经过板框过滤后，再经过超滤循环，制得液体酶制剂；脱色投料比为发酵液活性炭=90 100 :1，搅拌转速60 SOrpm，脱色时间 1 1.证；板框进料待出滤液后，先启动滤液上料泵打回流，滤液澄清后，打开袋式过滤器前的进料阀门，关闭回流阀，将滤液打往超滤循环罐；超滤浓缩工序清洗3 4bar条件下内循环10分钟，超滤压力稳定4 ^ar。
2.如权利要求1所述的一种产耐高温α-淀粉酶菌种的优化方法，包括下述的步骤a.菌种的活化培养平板培养基的配方牛肉膏0. 7%，蛋白胨1. 2%，氯化钠0. 5%，琼脂1. 8 %、余量为水，加热以上的组份使其溶解，调PH在7. 2，装瓶包扎，在0. IMpa下加热到121°C灭菌30min，冷却到45°C在无菌条件下倒平板或摆斜面，备用；接种与培养由冷冻管菌种划线接种于平板培养基，38°C，培养30h ；挑取单菌落接种于斜面培养基上，38°C，培养30h，保存备用；b.菌种的优化淀粉平板培养基的配方蛋白胨2%、酵母粉0. 5%、牛肉粉0. 7%、玉米淀粉1. 8%、葡萄糖 0.4% (单灭)、琼脂1.8%、余量为水，调pH为7.0，121°C下灭菌30分钟，无菌室中倒平板， 冷却备用；优化与培养将保存的菌种划线于淀粉平板培养基上，38°C培养30h，选出淀粉水解圈大的单菌落，来进行种子扩培；c.菌种的扩培种子培养基配方玉米淀粉10%、豆饼粉4%、硫酸铵1%、氯化钙0. 05%、磷酸氢二钾2%、 磷酸二氢钾2%、消泡剂0. 05%、余量为水，调pH7. 0，在121 °C下灭菌时间40min，降温到 36 0C -42°C，备用；种子的扩培将液体摇瓶种子液接入种子罐培养基中，接种量2. 5%, 38°C通风搅拌培养40h，接入发酵罐中；d.发酵后提取发酵结束后，发酵液脱色、经过板框过滤后，再经过超滤循环，制得液体酶制剂；脱色投料比发酵液活性炭=90:1，搅拌转速80 rpm，脱色时间1. 5小时；板框进料待出液后， 先启动滤液上料泵打回流，滤液澄清后，打开袋式过滤器前的进料阀门，关闭回流阀，将滤液打往超滤循环罐；超滤浓缩工序清洗4bar条件下内循环10分钟，超滤压力稳定恥虹。
全文摘要
本发明属于产酶菌种领域，具体涉及一种产耐高温α-淀粉酶-地衣芽孢杆菌10181的优化方法。一种产耐高温α-淀粉酶菌种的优化方法，包括下述的步骤a.菌种的活化培养；b.菌种的优化；c.菌种的扩培；d.发酵后提取。采用本发明的优化方法对产耐高温α-淀粉酶-地衣芽孢杆菌10181的进行优化，该菌种所产的耐高温α-淀粉酶其酶活达到11000u/ml，耐受温度高达110℃，而采用现有方法生产的耐高温α-淀粉酶其酶活一般在2500u/ml，耐受温度为95℃，因此，无论是从酶活还是从对温度的耐受能力上看，都要优于现有方法生产的α-淀粉酶，而且采用本发明的优化方法大大的降低了酶的生产成本。
文档编号C12N1/20GK102363761SQ20111036586
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者周颖, 尹彬彬, 陈建慧, 黄家英 申请人:山东安克生物工程有限公司