专利名称：基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的核酸检测方法
技术领域：
本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)的核酸检测方法。
背景技术：
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和其他禽类的接触性传染病。该病主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、 干酪样输卵管炎等，发病率高，病死率也高，耐过鸭多成僵鸭，生长迟缓，给养殖业造成极大的经济损失。自从1904年Reiemer首次报道该病到现在，该病呈世界流行，发病率和死亡率一般为10-30%，但部分鸭场达95%以上。该病对养殖业的危害除直接引起动物发病、死亡外，感染耐过鸭因饲料转化率降低，生长发育迟缓而带来的间接经济损失也十分严重，以及导致抗菌药物的大量使用而引起食品安全。传统鉴定鸭疫里默氏杆菌方法主要是通过细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定等经典方法，但经典方法操作繁琐、耗时长、检出率低等，对该病的准确检测和及时治疗十分不利。针对鸭疫里默氏杆菌其他检测技术如ELLSA、免疫组化及免疫荧光等技术也有报道， 但也不同程度地存在某些缺点。至上世纪80年代末聚合酶链反应技术诞生，极大的推动了分子生物学技术的发展，并促进了病原微生物核酸水平检测技术的长足发展，成为最重要的手段之一。而就鸭疫里默氏杆菌的检测而言，先后出现了重复序列PCR基因指纹 ^ff (Repetitive element PCR genomic finger printing，REP-PCR)、随机扩增多态性 DNA(Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD)以及实时荧光定量聚合酶链反应(Real time fluorescent quantified PCR)等一系列的核酸扩增检测技术。这些方法对鸭疫里默氏杆菌检测，较经典的鉴定方法而言更加的敏感及快速。其中荧光定量PCR技术，不仅仅具备PCR技术中的Taq酶对靶基因进行高效的扩增，而且探针的加入大幅度的提高了其特异性与敏感性，充分体现了分子检测技术的优越性。但是由于荧光定量PCR技术需要昂贵的仪器以及繁琐的操作过程，使得该技术在基层实验室以及检疫机构推广使用受到了局限。21世纪初，Notomi T等几位日本学者开发了一种新型的恒温扩增技术，即环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。其原理为采用能够特异性识别靶序列上8个区域设计的6个特异引物，利用一种具有链置换性Bst-DNA聚合酶在恒温条件(60°C -65°C )下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。其扩增效率可达到 IO9-IOltl个拷贝数的数量级，并且可以通过扩增副产物焦凝酸镁沉淀产生的浊度或者显色反应判断反应发生与否。LAM技术与PCR技术相比具有相同的灵敏度，而且LAMP省去复杂的温度变化、长时间的温度循环、繁琐的电泳检测等。LAMP技术使得整个检测过程在恒温水浴锅中即可完成，大幅降低了仪器成本，并且简便，适合于基层医疗防疫、检验检疫机构使用，可用于大量的样本同时检测。
发明内容
本发明提供一种基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的检测方法。一种基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的核酸检测方法，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域；所述特异性引物为
权利要求
1. 一种基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的核酸检测方法，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域；所述特异性引物为引物类别序列组成F3外引物5’ -AGAGCGAGAAGAAAAAACCT-3，B3外引物5' -CTCCCATAAGCATAGAGAAGA-3‘FIP内引物5 ‘ -GGTTCATTTCCCCAAGACCTTTATA-TAGAAATGTCTGCCGATGG-3‘BIP内引物5 ‘ -CAGAACAACTTTGGGAAACTACACT-CTATCTGCTTCACCTGCA-3LAMP检测的反应体系组成如下2xU-LAMP反应混合液OxU-LAMP反应混合液是购买的试剂盒，其组成为40mM Tris-HCKpH 8. 8)、20mM KCl、20mM(NH4)2S04、IOmM MgSO4、0· 2 % Triton Χ_100、2· 4mM dNTPsU. 6M 甜菜碱；)IOul ；IOx引物混合液Iul，其组成为引物F3为2uM，引物B3为2uM，引物BIP为12uM，引物 FIP 为 12uM ；模板DNAlul、Bst聚合酶0. 75ul、补水至20ul ； LAMP 反应条件:63°C 60min — 80°C 5min — _20°C保存。检测过程同时设置阴性对照和阳性对照，所述的阳性对照为含有鸭疫里默氏杆菌gyrB 目的基因的DNA(鸭疫里默氏杆菌基因组DNA或含鸭疫里默氏杆菌gyrB基因的重组质粒 DNA)，所述阴性对照为不同于靶基因的DNA，并使用电泳分析或Sybrgreen I荧光染料紫外灯下显色同时检测阴阳对照扩增产物。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，针对鸭疫里默氏杆菌中的Genbank登录号为CP002346. 1的gyrB基因设计环介导等温扩增特异性引物。
全文摘要
本发明公开了一种基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的核酸检测方法。所述方法为根据鸭疫里默氏杆菌gyrB基因设计特异性的引物序列，提取待测样品的DNA为模板，进行LAMP反应；对LAMP结果进行分析，若LAMP扩增结果为阳性，则待测样品含有鸭疫里默氏杆菌。本发明提供的针对鸭疫里默氏杆菌的检测方法，具有简便、快速、特异、灵敏和经济的优点，结果判断方法简便，适合于临床或者基层实验室使用，具有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102417930SQ201110369359
公开日2012年4月18日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者朱德康, 汪铭书, 王雪平, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学