专利名称：通用gapdh基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种操作简便、快速，且能够定量检测人、大鼠、小鼠三个物种甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，GAPDH 基因禾口 mRNA 表达的DNA体外扩增试剂盒，该发明属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增技术领域。
背景技术：
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)是现有的DNA体外扩增技术中最常用、也是最有效的技术；该技术系将耐热DAN聚合酶、特异引物、dNTPs底物、 模板DNA、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，从而达到靶DNA片段在反应液中呈2n倍扩增(其中η为热循环次数)；荧光定量 PCR技术则在PCR反应的基础上，耦合以实时荧光检测和计算机分析技术，即在PCR反应体系中加入特定的荧光物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光变化情况来实时探测DNA的扩增情况，并获得每个标本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值 (荧光变化达到阈值时的循环数)；同时，在相同的反应体系和反应条件下检测4-5个倍数稀释的已知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定；aqMan探针技术是目前最常用的荧光定量PCR技术；TaqMan探针是一条能够与待扩增检测的靶DNA序列互补配对的寡核苷酸，其5’端标记了一个荧光报告基团(R)，其3’端标记了一个荧光淬灭基团(Q)；当该探针处于游离状态或者没有发生反应时，R所产生的荧光将被Q淬灭；在PCR退火过程中，该探针可与目标基因发生杂交，并由TaqDNA聚合酶的依赖于聚合的外切活性切断，使得R与Q分离，游离的R发出荧光被荧光检测装置检测；随着 PCR反应的进行，游离的R与PCR产物相对应地增加；因此，根据R产生的荧光信号的强弱， 即可间接测量出PCR反应产物的数量；再依据标准曲线即可对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。
发明内容
在荧光定量PCR检测中，经常遇到检测基因相对表达量的情况，其中内对照基因常常选择GAPDH。有鉴于此，我们通过大量的实验研究优选出了一套能够有效检测人、大鼠、 小鼠三个物种GAPDH基因表达的引物和探针，优化出了其PCR反应的条件，并组装成通用 GAPDH基因表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学研究和医学检测的需要。本发明的技术方案是这样实现的首先获得人、大鼠、小鼠的GAPDH标准序列，进行BLAST同源性比较，再根据比较结果设计相应的引物和探针，最后将引物、探针加入含有耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板cDNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系中，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；并在中温时检测和记录荧光值。
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所优选出的引物和探针的序列分别如下上游引物Pl :5，-AAG CTC ATT TCC TGG TAT GAC A_3，(SEQ ID NO 1)；下游引物P2 :5，-ACA TGG CCT CCA AGG AGT AAG A_3，(SEQ ID NO 2)；TaqMan 探针序列5，-FAM-CAA CAG GGT GGT GGA CCT C-TAMRA-3，(SEQ ID NO: 3)；所优化出的PCR扩增缓冲反应体系是由引物、探针、耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、PCR缓冲液、超纯水等组成的，各个成分的终浓度分别如下特异的引物和探针每条 0. 28umol/L、Taq DNA 聚合酶 1. 5/50ul、dNTPs 底物 0. 25mmol/L、模板 cDNA 若干、 Mg++2. 5mmol/L、缓冲液 IXPCR ；其中 IXPCR 缓冲液包括 50mmol/L KClUOmmol/L Tris. HC1PH8. 3、0. 01% 明胶。该GAPDH荧光定量PCR由于引物和探针在人、大鼠、小鼠中完全同源，所以能够有效扩增来源于这些物种的GAPDH基因，从而检测GAPDH基因的表达量。根据上述研究结果，将上述引物、探针和其他PCR试剂混合后分装到PCR扩增管中，并配以 10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML 等系列稀释度的标准 GAPDH 基因模板组装成通用GAPDH基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒；标准GAPDH基因模板的序列为5 ’ -AAGCTCATTTCCTGGTATGACAACGAATTTGGCTACAGCAACAGGGTGGTGGCCTCATGGCCCACA TGGCCTCCAAGGAGTAAGA-3’ (SEQ ID NO 4)实施例11、在DNA合成仪上人工合成下述引物和探针各20D，并用TE缓冲液(其中含 IOmmoVUTrisa 含 10mmol/L EDTA)稀释至 10umol/L ；其中上游引物Pl 序列为5'-AAG CTC ATTTCC TGG TAT GAC A_3，(SEQ ID NO 1)；下游引物P2 5'-ACA TGG CCT CCA AGG AGTAAG A-3，(SEQ ID NO 2) ；TaqMan探针序列5，-FM_CM CAG GGT GGT GGA CCT C-TAMRA-3' (SEQ ID NO 3)2、取各引物、探针各 37. 5ul，25mmol/L dNTPs 18ul，、25mmol/L MgCl2150ul, 10XPCR反应缓冲液150ul，5U/ul Taq DNA聚合酶9ul，超纯水990. 5ul加入到2ml的干净无菌试管中，充分混勻，配制1400ul FQ-PCR反应预混液。3、将预混液成按46. 7ul/管分装成30小管(用200ul PCR扩增管)，再配以10E+8/ ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀释度的标准GAPDH基因模板5管，每管各20ul，即组装成了通用GAPDH基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒；其中标准GAPDH 基因模板的序列为5 ’ -AAGCTCATTTCCTGGTATGACAACGAATTTGGCTACAGCAACAGGGTGGTGGCCTCATGGCCCACA TGGCCTCCAAGGAGTAAGA-3’ (SEQ ID NO :4)4、FQ-PCR 扩增每个装有46. 7ulPCR反应预混液的反应管中分别加入3. 3ul待测cDNA，水或标准 GAPDH基因模板，震荡混勻，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪(如PE9700)中，96°C下变性 5分钟，然后按94°C 20秒，550C 30秒，60°C 30秒热循环45次，并在60°C时检测记录荧光信号；PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于3%琼脂糖凝胶行PCR产物电泳，溴乙锭染色，GelDoclOOO下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。
5.结果在30个标本的FQ-PCR反应中，经电泳检测，加入待测标本和标准品的反应产物中，均检测到了预期大小的85bp左右的PCR产物条带，而未加DNA标本的阴性对照未见相应扩增产物；加入标准GAPDH基因模板和待测标本的反应，均获得了 S形的荧光变化曲线， 加入标准GAPDH基因模板的Ct值，与加入模板拷贝数的对数呈线性关系，可以拟合成一条直线，斜率-3. 36，截距为41. 3，相关系数9. 9，说明该反应体系和反应条件均符合精确定量研究的要求。
权利要求
1.一种操作简单、快速，能够有效定量扩增检测人、大鼠、小鼠的GAPDH基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒；其中包含GAPDH特异的引物、探针和耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板 DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系，以及标准GAPDH模板。
2.根据权利要求1所述的通用GAPDH基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，其特征在于所用引物和探针序列分别为上游引物Pl :5，-MG CTC ATT TCC TGG TAT GAC A_3，(SEQ ID NO 1)；下游引物 P2 :5，-ACA TGG CCT CCA AGG AGT AAG A_3，(SEQ ID NO 2) ；TaqMan 探针序列5’ -FAM-CAA CAG GGT GGT GGA CCT C-TAMRA-3’ (SEQ ID NO :3)。
3.根据权利要求1所述的通用GAPDH基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，其特征在于特异的引物和探针每条0. 28umol/L, Taq DNA聚合酶1. 5/50ul、dNTPs底物0. 25mmol/ L、模板 cDNA 若干、Mg++2. 5mmol/L、缓冲液 IXPCR ；其中 IXPCR 缓冲液包括 50mmol/L KC1、 10mmol/L Tris. HCl ΡΗ8· 3、0· 01 % 明胶。
4.根据权利要求1所述的通用GAPDH基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，其特征在于标准 GAPDH 基因模板序列为5 ‘ -AAGCTCATTTCCTGGTATGACAACGAATTTGGCTACAGCAACAGGG TGGTGGCCTCATGGCCCACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA-3，(SEQ ID NO 4)；其浓度分别为 10E+8/ML、 10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML。
全文摘要
本发明涉及一种操作简单、快速，能够有效定量扩增检测人、大鼠、小鼠的GAPDH基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒；其中包含GAPDH特异的引物、探针和耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系，以及标准ACTB模板；其中所用引物和探针序列分别为上游引物P1(SEQ ID NO1)；下游引物P2(SEQ ID NO2)；TaqMan探针序列(SEQ ID NO3)；引物和探针浓度为每条0.28umol/L、Taq DNA聚合酶1.5U/50ul、dNTPs底物0.25mmol/L、模板cDNA若干、Mg++2.5mmol/L、缓冲液1XPCR；标准GAPDH基因模板序列为(SEQ ID NO4)。
文档编号C12Q1/32GK102443636SQ20111038285
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者刘钦松, 夏庆杰 申请人:山东博奥克生物科技有限公司