专利名称：一种催化二酰甘油酰基化的酶的制作方法
技术领域：
本发明属于酶蛋白技术领域，具体涉及一种催化二酰甘油酰基化的酶。
背景技术：
随着全球能源消耗量的不断上升，能源短缺的危机越发棘手。而生物柴油由于其良好的环保性、润滑性及安全性，作为一种新的可再生能源逐渐受到关注。但目前阻碍生物柴油商业化的主要原因是生产成本高，传统的生物柴油制备工艺复杂且产物纯度低，不利于大规模生产；因此通过基因工程技术改造产油微藻成为一种必然的趋势。而在产油微藻筛选实验中，假微型海链藻(T. pseudonana)的中性脂含量最高(王金娜等，2010)，而生物柴油的主要原料为中性脂，因此进一步提高假微型海链藻(T. pseudonana)的含脂量，降低生物柴油的生产成本，具有重要意义。二酰甘油酰基转移酶(diacylgycerol acyltransferase, DGAT)催化二酰甘油 (DAG)酰基化从而生成三酰甘油(TAG)，是Kermey途径的最后一步关键限速酶(kttlage S B, et al，JA0CS，75，7 :775-781)，对微藻的油脂合成具有重要的影响作用。近年来已发现该酶存在的类型为四种DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和胞质内DGAT。其中前两者蛋白主要结合在内质网膜上，是一种微粒体酶，后两者目前研究较少。目前对于假微型海链藻 (T. pseudonana) 二酰甘油酰基转移酶(DGAT)的研究仍属于空白阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来自于假微型海链藻中负责催化二酰甘油酰基化的酶，并可将所分离的酶用于遗传工程来制备高产油微藻，以弥补现有技术的不足。本发明提供一种催化二酰甘油酰基化的酶，其特征在于a、所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO 1 ；b、在a中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。本发明还提供一种核苷酸，用于编码上述的催化二酰甘油酰基化的酶。所述的核苷酸的序列为SEQ ID NO :2。本发明还提供一种重组质粒，用于表达本发明筛选出的催化二酰甘油酰基化的酶，该重组质粒携带的基因的序列为SEQ ID NO :2。上述的酶用于生物柴油的生产。本发明获得的来自于假微型海链藻中负责二酰甘油酰基化的蛋白经真核表达后得到的重组蛋白相对于其他酰基转移酶，具有明显促进拟南芥合成三酰甘油的作用，可应用于生物柴油的生产。本发明的二酰甘油酰基转移酶可应用于基因工程微藻的改造，能够更好地提高工程藻的产油量，大大减少生物柴油的生产成本。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook) 等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。实施例1 本发明的二酰甘油酰基转移酶基因的全长cDNA获取本发明首先利用RACE技术扩增二酰甘油酰基转移酶基因的全长cDNA，具体步骤为1,3' RACE操作及序列分析总RNA的提取和cDNA合成离心获取假微型海链藻的藻泥并滤干，参照 invitrogen公司Trizol抽提试剂说明书进行RNA提取。3'端基因片段的扩增采用Takara 公司3' -Full RACE Core Set Ver. 2. O试剂盒进行第一链的合成，得到10 μ IcDNA第一链产物。套式PCR反应根据假微型海链藻二酰甘油酰基转移酶基因的核心片段设计特异性弓丨物 Si，S2(S1 :5 ‘ -ATCATATCCTCCCTCGAAG-3 ‘ SEQ ID NO 3 ；S2 5' -TTGGGTCGATCTGATATCC-3‘ SEQ ID NO 4)。取 cDNA 2 μ 1 用于 Outer PCR 反应，体系 50 μ 1。反应条件为 94°C 3min ；94°C 30sec,60°C 30sec，72°C 2min 共 30 个循环；72°C IOmin0 取1st PCR产物Iul用于^mer PCR反应，体系50 μ 1，反应条件相同。扩增得到的片段约 1500bp，取割胶回纯后的DNA 2μ1用于连接反应，体系5μ1，全部用于转化。取200 μ 1转化液涂板，培养过夜。随机挑选10个阳性克隆进行鉴定，活化后送至irwitrogen公司测序鉴定。二酰甘油酰基转移酶3'端基因片段的序列分析生物信息学分析显示所测的二酰甘油酰基转移酶3'端基因片段序列为136^p，包括终止密码子共编码455个氨基酸。2,5' RACE操作及序列分析总RNA的提取和cDNA合成离心获取假微型海链藻藻泥并滤干，参照invitrogen 公司Trizol抽提试剂说明书进行RNA提取。5'端基因片段的扩增采用Clontech公司 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒进行第一链的合成，得到 10 μ 1 cDNA 第
一链产物。嵌套式PCR反应根据假微型海链藻二酰甘油酰基转移酶3'端基因片段的序列设计特异性引物 Pl，P2(P1 :5' -GGCTCCCTTCTTTGACATACCGAC-3‘ SEQ ID NO 5 ；P2 5'-CGACACCTCCGAAGCATTCCACC-3‘ SEQ ID NO :6)。取 cDNA 2μ1 用于 Outer PCR 反应，体系 50 μ 1。反应条件为 94°C 3min ；94°C 30sec，65°C 30sec，72°C 2min 共 30 个循环；72°C IOmin0 取1st PCR产物Iul用于hner PCR反应，体系50 μ 1，反应条件相同。扩增得到包括二酰甘油酰基转移酶开放阅读框的片段约2500bp，取割胶回纯后的DNA2y 1用于连接反应，体系5μ1，全部用于转化。取200 μ 1转化液涂板，培养过夜。随机挑选10个阳性克隆进行鉴定，活化后送至invitrogen公司测序鉴定。二酰甘油酰基转移酶5'端基因片段的序列分析生物信息学分析显示所测的二酰甘油酰基转移酶5'端基因片段序列为1200bp，包括起始密码子共编码400个氨基酸，其中有390个碱基与3'端基因片段重叠。3、二酰甘油酰基转移酶全长cDNA的获取及序列分析总RNA的提取和cDNA合成离心获取假微型海链藻藻泥并滤干，参照invitrogen公司Trizol抽提试剂说明书进行RNA提取。采用Takara公司试剂盒进行第一链的合成， 得到10 μ 1 cDNA第一链产物。
DGAT全长cDNA的扩增根据二酰甘油酰基转移酶5 ‘端和3'端基因片段的序列设计引物E1，E2(E1 :5' -TGCGAGCTCATGGACTCTACCCCCAGCG-3' SEQID NO 7 ；E2 5' -GACG GTACCTTATAACTCGGAATGGGCAC-3 ‘ SEQ ID NO 8)。取 cDNA 2 μ 1 并用高保真酶进行 PCR 反应，体系 50μ 1，。反应条件为 98°C 3min ；94°C 30sec,65°C 30sec,72°C 2min 共 30 个循环； 72°C IOmin0扩增得到包括二酰甘油酰基转移酶开放阅读框的片段约2500bp，取割胶回纯后的DNA 2 μ 1用于连接反应，体系5 μ 1，全部用于转化。取200 μ 1转化液涂板，培养过夜。 随机挑选10个阳性克隆进行鉴定，活化后送至invitrogen公司测序鉴定。
生物信息学分析显示假微型海链藻二酰甘油酰基转移酶基因的全长cDNA开放阅读框长2175bp，预测其编码一个含7 个氨基酸残基，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所述，其对应基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。
本发明的假微型海链藻中负责二酰甘油酰基化的蛋白前体肽和成熟肽均可以是通过化学合成、基因重组表达获得的产物。
实施例2 假微型海链藻二酰甘油酰基转移酶全长cDNA的异源表达。
以真核表达系统诱导表达假微型海链藻二酰甘油酰基转移酶的重组蛋白，具体步骤如下
1、重组质粒的构建与鉴定根据假微型海链藻二酰甘油酰基转移酶基因的全长 cDNA序列，在其两端分别弓I入限制性内切酶位点McI和KpnI位点，扩增本发明的假微型海链藻二酰甘油酰基转移酶，亚克隆进真核表达质粒PCAMBIA1300，测序确定为正确的插入基因载体。
2、重组质粒转化农杆菌GV3101感受态，在YEB (含50mg/L卡那霉素和125mg/L利福平)平板中培养2-3d，筛选转化子。挑取转化的农杆菌单菌落接种于YEB液体培养基(含50mg/L卡那霉素和125mg/L利福平)中，28°C 220rpm摇培16小时，用菌液做PCR。 PCR 条件-MV 5min ；94°C 30sec，65°C lmin,72°C 2min，共；35 个循环；72°C IOmin 后完成扩增。1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
3、拟南芥的遗传转化取含阳性克隆的菌液0. Iml接至50ml新鲜YEB液体培养基 (含50mg/L卡那霉素和125mg/L利福平)中，28°C 220rpm培养2_4h，使OD值达到0. 8左右。 取上述菌液Iml于EP管中，室温22°C 5500g，离心15min，弃去上清，用转化介质(V2MS大量，1 X 铁盐，1 X 微量，1 X 有机，5%蔗糖，0. 03% silwetL-77，20mg/L 乙酰丁香酮，0. Oyg/ ml苄氨基嘌呤(BAP)，KOH调pH值至5. 7)重悬沉淀至OD值达到0. 8左右。将待转化的三棵拟南芥植株平放，将其花蕾部分插入2mlEP管中，加入上述转化液后浸染5min。甩掉浸液并做上标记。
4、转基因拟南芥的培养与观察在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩住箱子暗培养过夜后，将拟南芥放置于塑料培养池内，并浇足horgland营养液使其恢复正常培养。同类的三棵正常拟南芥植株作为空白对照与其同条件培养。
5、转基因拟南芥和空白组拟南芥种子的三酰甘油(TAG)含量分析采用对拟南芥种子的总脂进行甲基化并进行气相色谱分析的方法。取拟南芥成熟种子和用刀片刮下的硅胶板上与三酰甘油标准样对应的TAG条带，装入事先盛有17:0脂肪酸内标的带塞试管中。在试管中加入1.5ml硫酸甲醇溶液(5%硫酸+95%甲醇)，充氮气密封。将试管在85°C水浴1小时，冷却后加入1. 5ml正戊烷和Iml水中止甲基化反应，振荡后2500rpm离心lOmin， 收集上清液，氮气吹干后加入20 μ 1重蒸的正己烷，取1 μ 1样进行气相色谱分析。三酰甘油(TAG)含量计算根据气相色谱分析结果，不同脂肪酸所对应的峰值与17:0脂肪酸内标作比较计算出总脂肪酸的量，再根据三酰甘油(TAG)的分子式推算出三酰甘油(TAG)含量。 结果发现转基因拟南芥种子中的三酰甘油含量明显高于空白组。 本发明分离的二酰甘油酰基转移酶，还包括在序列为SEQ ID NO 1 ；的氨基酸中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有二酰甘油酰基转移酶的活性，由本发明的酶衍生的酶。例如，将279位的酪氨酸替换为脯氨酸获得的序列为SEQ ID N0:9的酶，将观9 位的酪氨酸替换为组氨酸获得的序列为SEQ ID NO: 10的酶，将356位的赖氨酸替换为色氨酸获得的序列为SEQ ID NO :11的酶，将388位的色氨酸替换为蛋氨酸获得的序列为SEQ ID NO :12的酶，将414位的酪氨酸替换为苯丙氨酸获得的序列为SEQ ID N0:13的酶，将讨3位的亮氨酸替换为半胱氨酸获得的序列为SEQ ID NO :14的酶，将576位的谷氨酸替换为苏氨酸获得的序列为SEQ ID NO :15的酶，将666位的异亮氨酸替换为蛋氨酸获得的序列为SEQ ID NO 16的酶，这些酶用实施例2中的方法进行功能检测，结果显示衍生的酶也具有使转基因拟南芥种子中的三酰甘油含量提高的功能，从而证明衍生的酶也具有序列SEQ ID NO 1酶的功能。
权利要求
1.一种催化二酰甘油酰基化的酶，其特征在于a、所述酶的氨基酸序列为SEQID NO 1 ；b、在a中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有a中所述酶的活性的由a衍生的酶。
2.如权利要求1所述的催化二酰甘油酰基化的酶，其特征在于所述的酶是从假微型海链藻中分离的。
3.一种核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸用于编码权利要求1所述的催化二酰甘油酰基化的酶。
4.如权利要求3所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列为SEQIDNO :2。
5.一种重组质粒，用于表达权利要求1所述的催化二酰甘油酰基化的酶。
6.如权利要求5所述的重组质粒，其携带的核苷酸序列为SEQID NO :2。
7.权利要求1所述的酶在生物柴油生产领域中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种催化二酰甘油酰基化的酶，是从假微型海链藻中分离的，其氨基酸序列为SEQ ID NO1。本发明获得的来自于假微型海链藻中负责二酰甘油酰基化的蛋白经真核表达后得到的重组蛋白相对于其他酰基转移酶，具有明显促进拟南芥合成三酰甘油的作用，可应用于生物柴油的生产。本发明的二酰甘油酰基转移酶可应用于基因工程微藻的改造，能够更好地提高工程藻的产油量，大大减少生物柴油的生产成本。
文档编号C12P7/62GK102492672SQ20111038278
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月26日 优先权日2011年11月26日
发明者严小军, 刘必谦, 蒋瑜 申请人:宁波大学