专利名称：一种尾叶紫薇微卫星dna分子标记及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA分子标记技术，具体地说，涉及一种尾叶紫薇微卫星DNA分子标记及其应用。
背景技术：
尾叶紫薇(Lagerstroemia caudata),属千屈菜科(Lythraceae)紫薇属落叶大乔木，高18 30米，胸径约40厘米；树皮光滑，褐色，成片状剥落；全株无毛；花期4-5月，果期7-10月。尾叶紫薇开花繁密，香味浓郁，是培育芳香紫薇品种的优良亲本。其在石灰岩石山稍荫蔽的山坡上生长良好，萌蘖力较强，是石灰岩石山优良绿化树种之一。同时，尾叶紫薇木材坚硬、纹理细致，淡黄色，适于作上等家俱、室内装修、细工或雕刻等用材。尾叶紫薇原产于我国，已被列为濒危植物(《中国物种红色名录》第一卷，高等教育出版社，2004)。目前仅有关于尾叶紫薇单一种群结构的研究(黄晨晖等，2008，尾叶紫薇种群结构和动态的初步研究，热带林业，36 (4)，24 26)，而关于尾叶紫薇资源分布、种群遗传多样性和种质资源保护等方面的研究尚未见报道。简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)，也称微卫星DNA (microsatellite)，是一种由2 5个核苷酸为单位多次串联重复的长达几十甚至几百个核苷酸的序列。这些序列广泛存在于真核生物基因组的不同座位上，每个座位重复单位的数量可能不完全相同，因而形成多态性。由于其具有多态性丰富、重复性高、共显性遗传等优点，被广泛应用于植物的群体和进化遗传研究、种质资源遗传多样性分析、指纹图谱构建等领域。因此，开发尾叶紫薇微卫星标记，利用其研究尾叶紫薇资源遗传多样性和种群结构，对尾叶紫薇种质资源的保护和利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种尾叶紫薇微卫星DNA分子标记。本发明的另一目的是提供上述DNA分子标记的筛选方法。本发明更进一步的目的是提供上述DNA分子标记在尾叶紫薇遗传多样性研究中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种尾叶紫薇微卫星DNA分子标记，其中扩增所述分子标记的引物为如下引物对12HF : 5' -AAAGACGCAGAAGGATGG-3'I2HR:5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3'前述的DNA分子标记，其编号为I2H的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNo. 4所示。本发明的一种尾叶紫薇微卫星DNA分子标记的筛选方法，其包括以下步骤
(I)提取尾叶紫薇基因组DNA，用内切酶Rsa I进行酶切，得到大小为300 IOOObp 的 DNA 片段;(2)将寡核苷酸 SuperSNX24F (5 ’ -GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3 ’)和末端磷酸化的 SuperSNX24R(5’ -pGAITCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA-3’ )等摩尔混合，形成接头；(3)将步骤(2)的接头与步骤(I)的酶切产物连接；(4)以SuperSNX24F为引物，步骤(3)的连接产物为模板，进行PCR反应，富集大小为300 IOOObp的DNA片段；(5)合成3’ Biotin标记的探针20种，将其按照要求[Group2 = (AG)12, (TG)12,(AAC)6, (AAG)8, (AAT)12, (ACT)12, (ATC)8 ；Group3 = (AAAC)6, (AAAG)6, (AATC)6, (AATG)6,(ACAG)6, (ACCT)6, (ACTC)6, (ACTG)6 ；Group4 = (AAAT)8, (AACT)8, (AAGT)8, (ACAT)8, (AGAT)8]等体积混合(所有探针浓度均为100 u M)，将混合好的探针稀释100倍待用；(6)将步骤(4)的DNA片段分别与步骤(5)三组探针进行杂交；(7)向杂交后的溶液中加入磁珠，洗涤磁珠；(8)向洗涤后的磁珠中加入TE，得到含有微卫星DNA片段的上清液；(9)以SuperSNX24F为引物，步骤(7)的上清液为模板，进行PCR反应，得到目的片段；(10)将步骤⑶的扩增产物转化至大肠杆菌中，筛选转化子，进行PCR扩增，对产物大小为500 1200bp的菌液进行测序，得到50个微卫星序列，其中包含微卫星位点60个；(11)根据微卫星位点两端的侧翼序列设计引物并以8株尾叶紫薇个体基因组DNA为模板进行SSR-PCR扩增，得到尾叶紫薇微卫星标记15个，其编号分别为I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A，其核苷酸序列如 SEQID No. I 至 SEQ ID No. 15 所示。利用本发明的尾叶紫薇微卫星DNA分子标记分析尾叶紫薇个体间的遗传学差异，具体分析方法为(I)分别对 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A位点的特异性引物的正向引物的5’端进行6-FAM或JOE标记；(2)提取尾叶紫薇不同个体的基因组DNA ；(3)分别用标记后的 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A位点的特异性引物，扩增20株尾叶紫薇的基因组DNA。所述特异性引物的序列分别为IlGF :5' -joeGTCACAGGTTACCGAATC-3'IlGR :5' -ATGTAAATGGTGAGGAGG-3'I2BF =5' -6_famTTCTTGTCTTGGGTATCGC-3 '
12BR : 5' -GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3'12GF : 5' -J0ETTCTTCCACTTCCTCCTT-3'
12GR : 5' -CAGCCCACATTAACTTTT-3'12HF : 5' -6_famAAAGACGCAGAAGGATGG-3 '12HR : 5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3'
13GF : 5' -6_famATGTGGTGAATGGGAACT_3 '13GR : 5' -TTGGGCTAAAGATATGGA-3'I9HF:5' -6_famGGACCAGATTGTAAATGC-3 '19HR : 5' -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3'IlOHF :5' -joeATTCGATCTGCCCTCTTG-3'IlOHR :5' -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3'112HF : 5'-讓TCCCTTTAACGAGGAATG-3'
112HR : 5' -AAGTTTCTCGACGGCTTT-3'IIlCF :5' -joeGTGCTGGAGGAACTGCTA-3'IIlCR :5' -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3'II2CF :5'-讓TTTGGTGGTAGTGGGAGT-3'II2CR :5' -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3'II3AF :5' -6-famCCTAACAAGAAAGGAACAG_3'II3AR :5' -TTTCAGGACATCAGCACC-3'II3HF :5' -joeCCTCCTCCTGCCACTCCTCT-3'II3HR :5' -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3'II6AF :5' -6_famAGTTACTTATCTCCGCATTC_3'II6AR :5' -GACCATTTTACCCTTTCA-3'II8AF :5' -J0EAAGATATGCTGTTGAGTTT-3'II8AR :5' -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3'II12AF:5,-讓 CAACAGTAAAATTGGAGC-3'II12AR :5' -AGTAGTGATTCGGGTGGA-3'(4)分析PCR产物以及尾叶紫薇DNA多态位点的特征。本发明的优点在于，提供了 15个尾叶紫薇的微卫星位点及扩增该15个微卫星位点的引物序列和扩增方法，建立了尾叶紫薇的微卫星DNA分子标记技术体系，并利用这些标记进行尾叶紫薇遗传多样性分析、指纹图谱构建和分子标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的DNA分子标记。
图I为本发明IlG位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图2为本发明I2B位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图3为本发明I2G位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图4为本发明I2H位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图5为本发明I3G位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图6为本发明I9H位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图7为本发明IlOH位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图8为本发明I12H位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图9为本发明IIlC位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图10为本发明II2C位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图11为本发明II3A位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图12为本发明II3H位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图13为本发明II6A位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图14为本发明II8A位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；图15为本发明II12A位点的引物扩增20个尾叶紫薇基因组DNA的STR分型图；其中，图I 图15中1 20分别表示20个不同的尾叶紫薇单株，横坐标代表扩增产物大小，纵坐标代表扩增强度。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I尾叶紫薇微卫星文库的构建包括如下步骤(I)提取尾叶紫薇基因组DNA (DNA secure Plant Kit,购自天根生物)，用内切酶Rsa I和Xmn I进行酶切，酶切体系为2. 5 y L连接缓冲液(NEB)，0. 25 y L 100 XBSA (NEB),0. 25u L NaCl (5M)，I u LRsa I (NEB)，I u LXmn I (NEB), 20 u L DNA (100ng/L)，于 37。。，酶切40小时，得到大小为300 IOOObp的DNA片段； (2)将 10 ii M 寡核苷酸 SuperSNX24F (5 ’ -GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3 ’)和末端磷酸化的 SuperSNX24R(5’ -pGAITCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA-3’ )等体积混合，95°C变性10分钟，缓慢冷却至室温，形成接头；(3)将步骤⑵的接头7 U L、T4DNA连接酶(NEB) 2 ii L和10 X连接缓冲液I U L混合后，加入到(I)的酶切产物中，22°C连接2小时后，置于4°C连接40小时以上；(4)以SuperSNX24F为引物，步骤(3)的连接产物为模板，进行PCR反应，体系为 2.5iiL 10 X PCR 缓冲液，2. 5 ii L BSA, I. 3u L SuperSNX24F (10 u M), I. 5 u L dNTPs (各2. 5mM)，2 ii L MgCl2 (25mM), 13u L dH20,0. 2 u L Taq 酶(5U/ u L), 2 u L 连接产物，反应程序为 95°C 2min ；95°C 20sec,60°C 20sec，72°C I. 5min，35 个循环反应；15°C保温。用 2% 的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，富集大小为300 IOOObp的DNA片段；(5)合成3，Biotin标记的探针20种，分为三组,分别按照[Group2 = (AG)12,(TG)12, (AAC)6, (AAG)8, (AAT)12, (ACT)12, (ATC)8 ；Group3 = (AAAC)6, (AAAG)6, (AATC)6,(AATG)6, (ACAG)6, (ACCT)6, (ACTC)6, (ACTG)6 ；Group4 = (AAAT)8, (AACT)8, (AAGT)8, (ACAT)8,(AGAT)8]等体积混合(所有探针浓度均为100 PM)，将混合好的探针稀释100倍待用；(6)将步骤(4)的DNA片段分别与步骤(5)的三组探针进行杂交；杂交过程为将25 u L 2 X杂交溶液(12XSSC，0.2% SDS)，10 y L生物素标记的一组探针，10 y L步骤(4)的DNA片段，5 u L dH20混合，在PCR仪中进行杂交；杂交程序为95°C 5min,然后迅速降温到70°C，再以0. 040C /sec的速率降温到50°C，然后在50°C保温lOmin，再以0. 1°C /sec的速率降温到40°C，最后迅速降温到15°C保温；(7)加入 5O ii L 平衡后的磁珠(10mg/mL, Dynabeads M-280, Invitrogen),室温轻摇30分钟，使磁架分离，去除溶液；(8)用 400 ii L Wl 洗液(2 X SSC, 0. I % SDS)的清洗磁珠 2 次，弃溶液；用 400 u LW2洗液(I X SSC, 0. I % SDS)清洗磁珠2次，弃溶液；加入400 u LW2洗液，40。。轻摇2分钟，弃溶液；加入400 ii L W2洗液，50°C轻摇2分钟，弃溶液；加入400 u LW2洗液，45°C轻摇2分
钟，弃溶液；(9)重复步骤⑶一次；(10)加入200iiL TE，95°C保温5分钟，磁架分离后，得到含有微卫星DNA片段的
上清液；(11)以SuperSNX24F为引物，步骤(10)的上清液为模板，按照步骤⑷的反应体系和反应程序进行PCR反应，得到目的片段；
(12)将步骤(11)的扩增产物连接到 pCR2. l-T0P0(Invitrogen TOPO CloningKit)载体上，然后将连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，将转化菌液涂布在含有50 V- g/mL氨节青霉素和40mg/mL X-gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选。实施例2含尾叶紫薇微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序以及尾叶紫薇微卫星引物的设计包括如下步骤(I)用牙签挑取72个白色菌落并接种到含50 U g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，370C，150rmp培养40小时。以菌液为模板，进行PCR反应；PCR 反应体系为2. 5 ii L 250 u g/mL BSA,2. 5u L 10 X PCR 缓冲液，I y L IOmM 引物 M13F :5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’，I u L IOmM 引物 M13R : 5 ’-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ’，2u L25mM MgCl2,1. 5 u L 2. 5mM dNTP，0. 2 u LTaqDNA 聚合酶，I. 5u L 菌液，12. 8u L dH20 ;反应程序95°C 3min ；95°C 20sec,50°C 20sec,72°C I. 5min，35 个循环反应；15°C保温；(2)用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，选取PCR条带单一，产物大小为500 1200bp的菌液进行测序，得到50个微卫星序列，其中包含微卫星位点60个；(3)根据微卫星位点两端的侧翼序列设计引物并以8株尾叶紫薇个体基因组DNA为模板进行SSR-PCR扩增，10 ii L反应体系为包括IOng基因组DNA，I X PCR缓冲液(IOmM Tris-HCl，50mM KCl，pH 8. 3)，dNTPs (各 250 y M)，MgCl2 (I. 5禮)，正、反向引物(各0.5iiM)，Taq酶(0. 5U)，反应程序为95 °C 3min ；95 °C 30sec，最佳退火温度(48 60°C )30sec,72°C lmin，30个循环反应；72°C 5min，15°C保温。将各PCR产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上检测各引物多态性，筛选出非特异性条带扩增少、结果稳定、多态性丰富的微卫星标记 15 个，分别为 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A，其核苷酸序列如 SEQ ID No. I 至 SEQ ID No. 15 所示。实施例3利用尾叶紫薇微卫星DNA分子标记分析尾叶紫薇不同个体间的遗传学差
巳
升具体分析方法为(I)分别对 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A位点的特异性引物的正向引物的5’端进行6-FAM或JOE标记；⑵提取尾叶紫薇不同单株的基因组DNA (DNA secure Plant Kit,购自天根生物)；(3)分别用 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、118A、II12A位点的特异性引物，扩增20个尾叶紫薇个体的基因组DNA。10 y L反应体系为包括 IOng 基因组 DNA，I XPCR 缓冲液(IOmM Tris-HCl，50mM KCl，pH 8. 3)，dNTPs (各250 u M)，MgCl2 (I. 5mM)，正、反向引物(各 0. 5 ii M)，Taq 酶(0. 5U)，反应程序为 95°C 3min ；95°C 30sec，最佳退火温度(48 60°C )30sec,72°C lmin，30 个循环反应；72°C 5min，15°C保温；
所述特异性引物的序列分别为IlGF :5' -joeGTCACAGGTTACCGAATC-3'IlGR :5' -ATGTAAATGGTGAGGAGG-3'12BF : 5' -6_famTTCTTGTCTTGGGTATCGC-3 '12BR : 5' -GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3'12GF : 5' -joeTTCTTCCACTTCCTCCTT-3 'I2GR :5' -CAGCCCACATTAACTTTT-3'12HF : 5' -6_famAAAGACGCAGAAGGATGG-3 '12HR : 5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3'13GF : 5' -6_famATGTGGTGAATGGGAACT-3 '13GR : 5' -TTGGGCTAAAGATATGGA-3'I9HF : 5' -6_famGGACCAGATTGTAAATGC-3 '19HR : 5' -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3'IlOHF :5' -joeATTCGATCTGCCCTCTTG-3'IlOHR :5' -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3'112HF : 5' -6_famTCCCTTTAACGAGGAATG-3 '112HR : 5' -AAGTTTCTCGACGGCTTT-3'IIlCF :5' -joeGTGCTGGAGGAACTGCTA-3'IIlCR :5' -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3'II2CF :5' -6-famTTTGGTGGTAGTGGGAGT-3'II2CR :5' -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3'II3AF :5' -6-famCCTAACAAGAAAGGAACAG-3'II3AR :5' -TTTCAGGACATCAGCACC-3'II3HF :5' -joeCCTCCTCCTGCCACTCCTCT-3'II3HR :5' -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3'II6AF :5' -6-famAGTTACTTATCTCCGCATTC-3'II6AR :5' -GACCATTTTACCCTTTCA-3'II8AF :5' -joeAAGATATGCTGTTGAGTTT-3'II8AR :5' -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3'II12AF:5, -6-famCAACAGTAAAATTGGAGC-3 'II12AR :5' -AGTAGTGATTCGGGTGGA-3'所述特异性弓丨物的退火温度分别为50°C、50°C、50 V、50°C、50 V、50°C、50 V、50。。、52。。、54。。、52。。、60。。、48。。、52。。、54。。。(4)将PCR产物用ABI377遗传分析仪(Applied Biosystem公司)进行STR基因分型，使用GeneMapper 4. 0软件(Applied Biosystem公司)判读等位基因的具体数值；(5)使用Popgen I. 32计算期望杂合度、观察杂合度、多态信息量的值来描述尾叶紫薇DNA多态位点的特征,结果如表I所示表115个尾叶紫薇微卫星多态位点的特征
权利要求
1.一种尾叶紫薇微卫星DNA分子标记，其特征在于，其为如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
2.扩增权利要求I所述DNA分子标记的引物对，所述引物对为 I2HF:5' -AAAGACGCAGAAGGATGG-3'和I2HR:5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3'。
3.权利要求I所述的DNA分子标记在尾叶紫薇筛选或辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种尾叶紫薇微卫星DNA分子标记，其包括15个尾叶紫薇的微卫星位点。本发明还提供了该尾叶紫薇微卫星DNA分子标记的筛选方法及其在尾叶紫薇遗传多样性研究中的应用。此外，本发明还提供了扩增该15个尾叶紫薇微卫星位点的引物序列和扩增方法，建立了尾叶紫薇的微卫星DNA分子标记技术体系，并利用这些标记进行尾叶紫薇遗传多样性分析、指纹图谱构建和分子标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的DNA分子标记。
文档编号C12Q1/68GK102634513SQ20121001990
公开日2012年8月15日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者孙明, 宋平, 张启翔, 潘会堂, 王学凤, 田苗, 程堂仁, 蔡明 , 高亦珂 申请人:北京林业大学