一种用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物的制作方法

专利名称：一种用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物的制作方法
—种用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物所属领域本发明属于生物医疗技术领域，涉及一种新的结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌标志物， 其本质为人源电压门控质子通道Hvl。这项发明可在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌的诊断和预后中得到广泛的应用。
背景技术：
癌症是一大类恶性肿瘤的统称，由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。由于各种癌的发生部位不同，病理形态不同，以及发展阶段不同，因此会产生各种各样的临床表现。但癌症的早期往往症状很少，待发展到一定阶段后才渐渐表现出一系列症状和体征。一般将癌症的临床表现分为局疗表现和全身性症状两个方面。癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗；癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、 贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等等。我国目前已经成为恶性肿瘤多发国之一。恶性肿瘤包括癌和肉瘤，由上皮组织细胞来源的恶性肿瘤称为癌；由间叶组织来源的恶性肿瘤称为肉瘤。恶性肿瘤可以发生在各个年龄段。随着年龄的增加，癌的发病率会逐渐增加，尤其40岁以上的中老年人其发病率显著增加；肉瘤在儿童和青年人的发病率较高。恶性肿瘤对人类的危害不仅是威胁患者的生命，还给患者带来躯体的痛苦、精神压力和经济负担。目前常用的癌症诊断方式有以下几种影像检查，身体内某个部位的影像检查可帮助医生判断是否有肿瘤存在。X线检查是医生的最常用的方式，如胸片、X线检查骨骼等。 还有一些特殊的X线检查，如CT扫描用一台计算机与X-射线机连接，可得出一系列身体内的详细的图象。核磁共震(MRI)，将一块强有力的电磁铁与计算机连接，可得出与CT扫描类似但作用不同的图像。放射性核素扫描，患者口服或注射一种有轻度放射性的物质，由扫描器测量某些器官的放射线水平，然后由医生分析某器官内有无放射线浓聚的异常区域。 超声波，是检查身体内部结构的另外一种方法。这种不能被人听见的高频率声波进入身体， 然后反弹回来，这就形成一张超声图像。这些图片可显示在一台象电视机一样的屏幕上，也可在纸上打印出来。内窥镜检查，内窥镜检查时，医生将一根很细的管子通过咽喉、气管、食道、肠腔、阴道或子宫直接进行观察，同时可采集异常的组织或细胞进行病理分析。实验室检查，血液和尿检等的实验室检查可为医生提供重要信息。如果身体内有癌症，人体内某些物质的水平也会变得异常。通过实验室检测血液、脑脊液、大小便及痰等，可提示某些肿瘤的存在。病理切片检查，体检、影像检查、内窥镜和实验室检查可显示身体内有异常情况存在，但只有病理切片检查能最后确诊是否是癌症。在切片检查中，医生从异常地方取一小块组织样品或切除整个肿瘤。病理医生在显微镜下进行观察。如果确定癌症存在，病理医生通常能分出是什么种类的癌症，并能判断该肿瘤细胞生长快慢。因此，寻找恶性肿瘤的生物标志物，对于诊断癌症，尤其是早期诊断癌症和判断预后有极大帮助。这个标志物必须在正常组织中极少表达，而在癌组织中大量特异表达，不仅仅可用来诊断癌症或判断预后、协助分期等，同时还可以被用作免疫导向治疗的靶位点。可以说，癌症的生物标志物在恶性肿瘤的诊断、预防、治疗、判断预后等方面均起着重要的作用。结直肠癌为结肠癌和直肠癌的总称，结直肠癌是指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变预后不良，死亡率较高。结直肠癌是大肠粘膜上皮起源的恶性肿瘤，是最常见的消化道恶性肿瘤之一，发生率仅次于胃癌和食道癌。结直肠癌在不同地区，其发病率有明显区别。据世界肿瘤流行病学调查统计，经济发达的国家发病率较高，不同国家的发病率相差60倍。结直肠癌在北美、西欧、澳大利亚、 新西兰等地的发病率最高，日本、智利、非洲等地则低。在西方发达国家，结直肠癌是仅次于肺癌的第二位恶性肿瘤。根据有关资料显示，非洲结直肠癌的发病率似乎非常低。一般来说，在世界范围内我国属于低发区。近年来结直肠癌同肺癌一样有上升趋势，我国亦不例外。该病在国内的发病率亦有地区差异，以上海、浙江、福建为高发区。在我国常见恶性肿瘤死亡中，结直肠癌患者在男性占第五位，女性占第六位。男性结直肠癌的发病率明显高于女性，约为1.6 I。近二十年来结直肠癌的发病率在逐渐增加，同时，其发病年龄趋向老龄化。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60%。发病率年龄方面资料，据国内统计，以40 50岁为多，年龄组中位数为45左右，40岁以下者全部病例的1/3左右，30岁以下者占10%左右。高发国家大肠癌高发年龄为60 70岁， 30岁以下者占6%左右。我国结直肠癌好发年龄比国外提早10 15岁，30岁以下者占 11% 13%，这是我国结直肠癌的一个主要特点。寻找结直肠癌的生物标志物，对于诊断结直肠癌，尤其是早期诊断结直肠癌和判断预后有极大帮助。这个标志物必须在正常组织中极少表达，而在结直肠癌组织中大量特异表达，不仅仅可用来诊断结直肠癌或判断预后、协助分期等，同时还可以被用作免疫导向治疗的靶位点。可以说，结直肠癌的生物标志物在结直肠癌的诊断、预防、治疗、判断预后等方面均起着重要的作用。目前常用于检测结直肠癌的生物标志物主要由以下几种(1)血清癌胚抗原 (CEA)测定在结直肠癌患者血清中，可以检测到癌胚抗原(CEA)，这是一种糖蛋白，常出现于恶性肿瘤患者血清中，并非结直肠癌的特异相关抗原，故血清CEA测定对本病的诊断不具有特异性。但用放射免疫法检测CEA，作定量动态观察，对判断结直肠癌的手术效果与监测术后复发有一定意义。如结直肠癌经手术将肿瘤完全切除后，血清CEA则逐渐下降；若复发，又可再度升高。(2)CA19-9是一种糖蛋白类的肿瘤标志物，在消化道肿瘤患者的血清中含量明显升高。血清CA19-9浓度与Duke分期呈正相关，随着分期的升级浓度升高，因此浓度的大小对于判断结直肠癌的预后有临床应用价值。但血清检测CA19-9的阳性率较低，仅有22. 39%，在各Duke分期中，血清与组织中CA19-9的阳性率差异情况与CEA相同。Duke A Duke C期中，通过血清检测CA19-9的阳性率均明显低于术后组织，尤其是在Duke A期患者，检测血清CA19-9的结果为阴性。CA19-9对结直肠癌的早期诊断价值不高，但对结直肠癌的疗效观察和复发监测具有重要临床意义。(3)CA50以脂或脂蛋白结合的形式存在于细胞膜，属于鞘糖脂类标记物，是胰腺和结直肠癌的标志物。结直肠癌的发生、发展中伴随一系列分子生物学的改变，理想的肿瘤标记物应具有较高的敏感性和特异性，并能反应肿瘤的进展及治疗效果。然而至今尚没有一种肿瘤标志物能满足上述条件，因此寻找一种敏感性、特异性都比较理想的标志物，尤其在结直肠癌早期诊断方面具有重要作用，具有广阔的应用前景。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占女性恶性肿瘤的 6. 7% -14. 9%，仅次于子宫癌。经手术治疗后约50%病例可治愈，其余50%的病例可能复发或转移。乳腺癌是乳房腺上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生了基因突变，致使细胞增生失控。因为癌细胞的生物行为发生了改变，而导致细胞呈现出无序、无限制的恶性增生。 它的组织学表现形式是大量的幼稚化的癌细胞无限增殖和无序状地拥挤成团，挤压并侵蚀破坏周围的正常乳房组织结构。由于乳腺癌细胞很容易脱落游离，随血液或淋巴液等播散全身，形成早期的远端转移，导致其临床治愈困难。全身重要脏器的转移如肺转移、脑转移、骨转移等都将直接威胁人的生命，因此乳腺癌是严重危及人体生命的恶性疾病。乳腺癌细胞存在的一些特异性抗原性物质，对于乳腺癌的检测有极大帮助。通过对于这些标志物的检测，便可得到活检或手术标本是否是乳腺癌。目前已经发现的乳腺癌标志物有十几种，它们或与人源乳腺癌内分泌直接相关，或可辅助乳腺癌诊断，或与乳腺癌预后相关。这些抗原包括雌激素受体(estrogen receptor ER)、孕激素受体(progesterone receptor PR),雄激素受体(androgen receptor AR), PS2 基因又称乳腺癌雌激素诱导基因(breast cancer estrogen induced, BCEI), CA15 抗原，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA),泌乳素(prolactin, PRL),肿瘤易感基因(BreastPovarian cancer susceptibility gene, BRCA1), p53 抑癌基因，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA), C-erbB-2 (HER-2/ neu)基因，组织蛋白酶D(Cath印sin-D，Cath-D)，p27抑癌基因，p21抑癌基因，转移抑癌基因nm23等。常规临床分期对乳腺癌的远期判断不理想，需要建立新的对临床有指导意义的方法，研究表明，反映肿瘤生物行为的一些标志物能更准确地判断乳腺癌的预后。所以，我们可以说，乳腺癌的标志物在乳腺癌的诊断和判断预后等方面起着重要的作用。当然，这些标志物在乳腺癌组织或细胞表面的表达的越特异，它在诊断和预后中的作用就越准确和明显。综上所述，寻找一种特异性高、在乳腺癌中表达阳性率高、位于乳腺癌细胞表面、 对人具有抗原性的乳腺癌的生物标志物对于人乳腺癌的诊断和预后具有十分重要的意义。胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，是恶性肿瘤中最常见的，多发生于胰头部。 腹痛及无痛性黄疸为胰头癌的常见症状。糖尿病患者长期大量吸烟，高脂肪高动物蛋白饮食者，发病率相对增高，本病多发于中老年人，男性患者远较绝经前的妇女多，绝经后妇女发病率与男性相仿。发病原因尚不清楚，发现些环境因素与胰腺癌的发生有关。已定的首要危险因素为吸烟，糖尿病胆石病饮酒(包括啤酒)以及慢性胰腺炎等进食高脂肪高蛋白饮食和精制的面粉食品，胃切除术也是发生胰腺癌的危险因素，其死亡率极高。1943年，Rockeg首先实行了全胰切除术。国内余文光于1954年首先报告胰头十二指肠切除的病例。近年来，胰腺癌的发病率逐年上升，在美国1988年发病率为9. 0/10万， 男女为I. 3 I。多见于45岁以上者。瑞典发病率较高，为125/10万，并且在过去20年里保持不变。英国和挪威各增加了 I倍。70年代与60年代相比，加拿大、丹麦和波兰的标化发病率增加了 50%以上。在中国，胰腺癌已成为人口死亡的十大恶性肿瘤之一。北京协和医院近年来收住院的胰腺癌病人比50年代增加了 5 6倍。而且据北京地区7家医院 354例病例分析，病人中41 70岁者占80%，近年来，年轻的胰腺癌病人也较10年前有明显增加的趋势，而且恶性度更高，预后更差。就胰腺癌的发生部位而言，仍以胰头部位最多见，约占70%左右，胰体次之，胰尾部更次之，有的头体尾部均有，属于弥漫性病变或多中心性病变。目前发现与胰腺癌相关的肿瘤标志物有10多种，临床常用的除CA19-9外，还有 CA50、Span-1、Dupan_2、POA, CEA等。目前国内所用的试剂多为进口的，较昂贵，多数医院尚未能普及。但肿瘤标记的检测对胰腺癌的筛选、诊断术后复发及转移的监测，以及胰腺良恶性肿瘤的鉴别都有着重要作用。若用两种或两种以上的肿瘤标记物检查可提高其阳性率。l、CA19-9是胰腺癌的相关抗原，其表达依赖于lewis血型抗原的表达，lewis阴性者， CA 19-9的检查也为阴性。CA19-9诊断胰腺癌的敏感性、特异性和准确性分别为83. I %、 73%、75%，而小胰腺癌病人CA19-9的水平不高，小于2cm的胰腺癌阳性率仅60. 7%，而肿瘤较大的病人CA19-9的水平较高，阳性率达80%以上，分界值定为120kU/L，高于此值者高度怀疑胰腺癌。同时还可以判断预后，肿瘤切除后CA19-9降至正常值，血清临界值为30kU/ L者预后较好，如果肿瘤复发、转移或病情恶化可见CA19-9的再度明显升高。故CA19-9是胰腺癌的有效标记物。2、CA50也是lewis系统的一个抗原，与CA19-9有很好的相关性，不必同时将这两个抗原一起测定。但若将CA50和CA242联合检测可提高对胰腺癌诊断的敏感性。3、Span-l胰腺癌病人可高达1446KU/L。其敏感性为81%，特异性为68%，但对于小胰腺癌的诊断不理想，小于2cm的肿瘤阳性率仅为56%。4、Dupan-2其临界值为400KU/L， 对胰腺癌的敏感性为50 % 70 %，与CA19-9联合检测可使阳性率提高到95 %，胆受肝功能的影响，与GOT有密切相关。5、CEA(癌胚抗原)阳性率78. 9%，对于低分化胰腺癌> 3cm 肿瘤以及临床IV期的胰腺癌阳性率明显提高，CEA阴性者平均生存期为38. 6个月，比阳性者明显延长，可以用来判断预后。上述这些胰腺癌的生物标志物，尚不能广泛开展，特异性偏低，对早期癌和小胰腺癌(<2cm的肿瘤)阳性率更低，尚存在一定的假阳性和其他肿瘤的交叉反应。因此，寻找一种特异性强，阳性率高的生物标志物对胰腺癌的早期诊断和预后具有重要的意义。

发明内容
本发明目的是为了解决结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌缺乏敏感性、特异性标志物的问题，提供一种以电压门控质子通道Hvl作为结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物。本发明涉及一种新的人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物电压门控质子通道Hvl。Hvl在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中高表达，在正常组织和良性瘤中不表达；Hvl在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中的表达水平和癌症的临床分期及病人的存活率有关，因此Hvl可作为结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物。本发明提供的用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物，为人源电压门控质子通道Hvl，其基因是序列表SEQ ID No. I所示的序列；其基因编码的标志物人源电压门控质子通道Hvl是序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸残基序列。所述标志物人源电压门控质子通道Hvl蛋白全长为273个氨基酸残基，依据该通道各氨基酸残基的疏水特性，可将Hvl蛋白全长划分为3个结构域N-端胞内结构域、跨膜结构域和C-端胞内结构域；Hvl对质子具有特异的高选择性，能够高效地跨膜转运质子。本发明提供了结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl相应的多克隆和单克隆抗体、 抗体片段及衍生物。所设计的人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl的C端引物如序列表 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。我们的研究表明人源电压门控质子通道Hvl在人的结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中高表达，而在正常和良性瘤组织中基本不表达。Hvl在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中的表达水平和肿瘤的恶性化程度有关，Hvl在恶性化程度高的肿瘤中表达量高、在恶性化程度低的肿瘤中表达量低。同时，Hvl在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中表达水平和病人的存活率有关，Hvl表达量高的病人预后不好，死亡率高。因此利用电压门控质子通道Hvl 作为结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物，可以用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌的诊断和预后。由于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌缺乏特异性标志物用于诊断和预后，因此该标志物具有十分广阔的应用前景和潜在的巨大的社会效益。我们的研究表明Hvl对结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌的生长、侵袭和迁移起关键性作用。抑制Hvl在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌中的表达明显抑制肿瘤的生长、侵袭和迁移能力。其机理是因为Hvl参与调节肿瘤细胞内的pH值，维持肿瘤细胞内稳定的pH值。 在本发明中我们提供人源电压门控质子通道HvI作为结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物。运用Hvl的多克隆和单克隆抗体，用免疫组织化学等方法来检测Hvl 在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中的表达水平，从而来诊断和预后。本发明提供了以Hvl来诊断和预后结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌的方法；结直肠癌、 乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl相应的多克隆和单克隆抗体、抗体片段及衍生物。本发明可在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌的诊断和预后中得到广泛的应用，具有潜在的巨大的社会效益。本发明的优点和积极效果本发明提供的作为结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物，即电压门控质子通道Hvl是一种在人的结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中高表达，而在正常和良性瘤组织中不表达。Hvl在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中的表达水平和肿瘤的恶性化程度有关，Hvl在恶性化程度高的肿瘤中表达量高、在恶性化程度低的肿瘤中不表达。同时，Hvl 在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中表达水平和病人的存活率有关，Hvl表达量高的病人预后不好，死亡率高。因此利用电压门控质子通道Hvl作为结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物，可以用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌的诊断和预后。由于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌缺乏特异性标志物用于诊断和预后，因此该标志物具有十分广阔的应用前景和潜在的巨大的社会效益。


图I是Hvl在结直肠癌中的表达A(IOOX)，B(500X)，C(IOOX)和D(500X)，为正常结直肠组织;E(100X)和F(500X)腺瘤组织；G(100X)，H(500X)，I (100X)，J(500X)， K(IOOX)和L(500X)为结直肠癌组织。正常组织包括增生和腺瘤，染色为阴性和弱阳性。在癌组织中，Hvl显示强阳性。Hvl染成棕色，细胞核为蓝色。图2是Hvl在结直肠癌细胞系中的表达SW620，HT29，LS174T，Colo205和SW480 细胞，分别用免疫细胞化学(A)和实时定量PCR(B)检测。A.HT29(a，200X)，LS174T(b， 200X)，Colo205(c，200X)，SW480 (d, 200X), SW620 (e, 200X)和 SW620 (f, 500X)用免疫细胞化学检测。B.用实时定量PCR检测Hvl在SW620, HT29, LS174T, Colo205和SW480细胞中mRNA表达水平。所有细胞与SW620比较。图3是Hvl表达量和存活率的关系高低表达Hvl的结直肠癌病人总生存曲线和无病复发生存曲线。低表达病人比高表达病人总生存期和无病复发生存期长。A.总生存曲线，B.无病复发生存曲线图4是Hvl在乳腺癌中的表达病人的乳腺癌组织样品用anti-Hvl抗体染色。在正常乳腺组织(A)和乳腺增生组织(B和C)Hvl染色成阴性或弱阳性，但在乳腺癌组织中成中染色和强染色(D-I)。Hvl染色区成褐色，细胞核成蓝色。A，B，D，F和H为200倍；C，E， G和I为500倍。阴性对照用小鼠非免疫血清代替免疫血清。图5 是Hvl 在乳腺癌细胞系中的表达 MCF-7，MDA-MB-231，T-47D，SK-BR-3， MDA-MB-468和MDA-MB-453细胞，分别用免疫细胞化学(A)和实时定量PCR(B)检测。A. MCF-7(a，200X)，MDA-MB-231 (b，200X)，T-47D (c，200X)，SK-BR-3 (d，200X)， MDA-MB-468 (e, 200X)和MDA-MB-453 (f，200X)用免疫细胞化学检测。B.用实时定量PCR 检测 Hvl 在 MCF-7，MDA-MB-231, T-47D，SK-BR-3, MDA-MB-468 和 MDA-MB-453 细胞中 mRNA 表达水平。所有细胞与MDA-MB-231比较。图6是Hvl表达量和存活率的关系Hvl表达量和存活率的关系高低表达Hvl的乳腺癌癌病人总生存曲线和无病复发生存曲线。低表达病人比高表达病人总生存期和无病复发生存期长。A.总生存曲线，B.无病复发生存曲线 图7是Hvl在胰腺癌中的表达。A (100 X)和B (500 X)，胰腺癌组织阴性对照(用 Balb/c鼠非免疫血清代替Hvl抗体)；C(100X)和D(500X)，为#379689胰腺癌组织； E(IOOX)和 F(500X)为 #380190 胰腺癌组织；G(IOOX)，H(500X)为 #380333 胰腺癌组织。Hvl在不同恶性程度的胰腺癌组织中染色强弱不同，恶性程度高的胰腺癌组织中Hvl显示强阳性，在恶性程度低的胰腺癌组织中染色为弱阳性。Hvl染成棕色，细胞核为蓝色。
具体实施例方式病人和组织样本结直肠癌组织样本是从通化中心医院外科手术得到的，为2001年到2007年的组织样本。这些病人未经过放化疗治疗。139例结直肠癌组织及相应的癌旁组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋。这些病人的病历资料在表一中给出。另外，为了证实Hvl表达的特异性，我们也选了未癌变的组织，10例正常结直肠组织，18例增生组织，以及20例腺瘤组织。 每个病人的病理资料都根据肿瘤分期，肿瘤大小，淋巴节状态分类。肿瘤分化程度根据埃德蒙森分级法。乳腺癌组织样本是从通化中心医院外科手术得到的，为2001年到2007年的组织样本。这些病人未经过放化疗治疗。105例乳腺癌组织及相应的癌旁组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋。这些病人的病历资料在表二中给出。另外，为了证实Hvl表达的特异性，
8我们也选了未癌变的组织，8例正常乳腺组织，20例乳腺增生组织。每个病人的病理资料都根据肿瘤分期，肿瘤大小，淋巴节状态分类。肿瘤分化程度根据埃德蒙森分级法。胰腺癌组织样本是从天津市肿瘤医院外科手术得到的，为2004年到2008年的组织样本。这些病人未经过放化疗治疗。152例胰腺癌组织及相应的癌旁组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋。另外，为了证实Hvl表达的特异性，我们也选了 10例正常胰腺组织。每个病人的病理资料都根据肿瘤分期，肿瘤大小，淋巴节状态分类。肿瘤分化程度根据埃德蒙森分级法。实施例I电压门控质子通道Hvl (人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌重组蛋白抗原)的制备之一首先设计出新的人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl的C端引物，序列如下C-Hvl BamH I-F :5，CGCGGATCCAAGACACGTTCAGAACGGC(序列 3)EcoR I-R :5，CGGAATTCCTAGTTCACTTCACCAAGAAG(序列 4)通过PCR扩增，双酶切PCR产物和载体pGEX6p_l并回收，连接，得到重组质粒。这个克隆就是含有本发明提到的电压门控质子通道Hvl (人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌抗原)DNA序列的重组表达质粒的克隆，它命名为pGEX6p-l-c-Hvl。将pGEX6p-l-c_Hvl转化到感受态E. coli BL21(DE3)大肠杆菌，使用O. 5mM IPTG诱导剂，进行蛋白表达。通过离子交换柱纯化得到电压门控质子通道Hvl蛋白(人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌重组蛋白抗原)，基因序列如序列表序列I所示、氨基酸序列如序列2所示。电压门控质子通道Hvl (人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌抗原)的制备之二人工合成多肽，序列为CSEKEQEIERLNKL，然后把该多肽和血蓝蛋白(或牛血清白蛋白按质量I比I连接，得到人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌抗原(keyhole limpet haemocyanin (KLH)-conjugated Hvl peptide CSEKEQEIERLNKL)(序列 5)。实施例2 (一 )抗人源结直肠癌抗原Hvl兔多克隆抗体的制备采用4mg/每只实施例I获得的人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl的重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂多点皮下免疫新西兰大耳白兔，10天后采用4mg/每只人源结直肠癌抗原Hvl的重组蛋白抗原混合不完全福氏佐剂多点皮下第二次免疫新西兰大耳白兔。第二次免疫后，间隔一周进行第三次免疫。第三次免疫后10天采血测效价，当效价> I 106，处死动物采血，采用凝结法收集血清，低速离心去沉淀。用生理盐水I : 2稀释， 上ProteinA亲和层析柱纯化，pH2. 8的O. IM甘氨酸缓冲液洗脱，IM Tris中和后对PBS透析3次，检测0D280定抗体含量，获得抗人源结直肠癌抗原Hvl的兔多克隆抗体。如果效价 < I 106，则继续免疫至效价> I : 106。( 二)抗人源结直肠癌抗原Hvl小鼠单克隆抗体采用IOOug/每只实施例I获得的新的人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂皮下免疫Balb/c小鼠,4周后采用50ug/每只重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂腹腔加强免疫，4周后再次采用50ug/每只重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂腹腔加强免疫，总共3次加强免疫，10天后采血测效价，当效价> I : 106，处死动物，收集脾组织，使其通过100目的筛网分离为单细胞。采用50%的PEG促融合法将500万脾细胞与100 万SP2/0细胞融合，融合后采用HAT培养基进行筛选培养。培养I周后采用人源乳腺癌重组蛋白抗原包被的ELISA进行筛选，阳性克隆连续进行亚克隆，筛选稳定分泌特异抗体的克隆，获得抗人源乳腺癌抗原Hvl的鼠单克隆抗体。实施例3 用电压门控质子通道Hvl的抗体检测结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌采用常规免疫组化方法，石蜡切片，以山羊血清封闭，一抗采用小鼠抗人结直肠癌抗原Hvl多克隆抗体，二抗采用山羊抗小鼠IgG-HRP，DAB显色，苏木精染细胞核。结果如图1，图4和图7所示，在癌组织上着色密集，同时在正常的组织未被染色。 证明电压门控质子通道Hvl在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌细胞中高表达。结直肠癌染色结果根据IRS方法，分别由两个不同的病理医生打分，0-3分为Hvl 低表达，4-12分为Hvl高表达。使用SPSS17. O统计数据，如表三所示，Hvl的表达情况与肿瘤大小，肿瘤分级，淋巴结状态和临床分期有关，与其他因素无关。乳腺癌染色结果根据IRS方法，分别由两个不同的病理医生打分，0-3分为Hvl低表达，4-12分为Hvl高表达。使用SPSS17. O统计数据，如表四所示，Hvl的表达情况与肿瘤大小，肿瘤分级，淋巴结状态和临床分期有关，与其他因素无关。实施例4 电压门控质子通道Hvl与结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌病人生存和复发的关系通过电话回访的方式，得到每个病人目前存活和有无复发的情况，使用SPSS17.0 统计数据，如表五，表六和表七，表八所示，病人的存活率和复发情况与Hvl表达水平有直接关系。实施例5 结直肠癌中p53，Ki-67，TopoII, GST- 和P_gp表达水平与病理参数之间的关系用已知的p53，Ki-67, TopoII, GST- Ji和P_gp抗体分别对结直肠癌组织进行免疫染色，结果统计入表九所示。P53与肿瘤分级有关(P = O. Oil)，Ki-67与分化有关(P = O. 010)，TopoII与分化有关(P = O. 010)，GST- π与肿瘤大小有关(P = O. 007)，与分化有关(P = O. 000)。乳腺癌中ER，PR，Her-2，Ki-67, TopoII, GST- Ji和P_gp表达水平与病理参数之间的关系用已知的ER，PR，Her-2, Ki-67, TopoII, GST- 和P_gp抗体分别对乳腺癌组织进行免疫染色，结果统计入表十所示。Her-2表达与肿瘤分级有关(P = O. 015)，与淋巴结状态有关(P = O. 058)，与临床分期有关(P = O. 029)。与肿瘤分级有关(P = O. 012)。TopoII 与肿瘤大小有关(P = O. 005)。表一结直肠癌临床病理资料
权利要求
1.一种用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物，其特征在于所述的标志物为人源电压门控质子通道Hvl，其基因是序列表SEQ ID No. I所示的序列。
2.根据权利要求I所述的用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物，其特征在于所述的标志物人源电压门控质子通道Hvl是序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸残基序列。
3.根据权利要求2所述的用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物，其特征在于所述标志物人源电压门控质子通道Hvl蛋白全长为273个氨基酸残基，依据该通道各氨基酸残基的疏水特性，可将Hvl蛋白全长划分为3个结构域N-端胞内结构域、跨膜结构域和C-端胞内结构域；Hvl对质子具有特异的选择性，能够高效地跨膜转运质子。
4.根据权利要求1、2或3所述的用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物， 其特征在于所设计的人源结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl的C端引物如序列表SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。
全文摘要
一种用于结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物。本发明以人源电压门控质子通道Hv1作为标志物，运用免疫组织化学等方法来诊断结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌，并以Hv1作为判断预后的指标。Hv1的基因序列和氨基酸序列如序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。Hv1在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中高表达，而在正常和良性瘤组织中不表达。Hv1结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中的表达水平和肿瘤的恶性化程度有关，在恶性化程度高的肿瘤中表达量高。同时，Hv1结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌组织中表达水平和病人的存活率有关，Hv1表达量高的病人预后不好，死亡率高。因此利用Hv1作为结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌诊断和预后的标志物，具有广阔的应用前景和潜在的社会效益。
文档编号C12N15/11GK102584978SQ20121007074
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者李树杰, 王一凡 申请人:李树杰