专利名称：含有热休克蛋白hsp70c的用于促进汉坦病毒融合蛋白g2s0.7提呈的重组腺病毒表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及分子生物学、免疫学及免疫应用等相关领域。本发明涉及腺病毒重组转移载体的改建及其对肾综合征出血热(HFRS)致病原的ー种用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病毒高表达载体G2S0. 7-pCAG。
背景技术：
肾综合征出血热及其基因工程疫苗研究现状肾综合征出血热(hemorrhagicfever with renal syndrome, HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus，HV)引起，由鼠类等传播的ー种急性病毒性传染病，临床上以发热、出血和急性肾功能损害为主要特征。中国是世界上HFRS疫情最严重的国家，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点，到目前为止临床上尚缺乏特异有效的治疗药物。为易感人群接种疫苗是预防传染性疾病大規模扩散最有效的防控措施。因此，针对HFRS疫苗的研究一直是该领域的热点。国内外近年来虽已研制出HFRS的灭活疫苗，但从部分人群试用的情况来看，该类疫苗还存在明显不足，主要是其诱导机体产生中和抗体的能力较弱，也不能有效地刺激细胞免疫应答。目前在HFRS基因工程疫苗基础研究中主要使用的是病毒囊膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，但GP免疫原性相对较弱，刺激机体产生的抗体出现较晚，滴度亦不高。本发明人多年对HV中免疫原性最強的核蛋白(NucleocapsidProtein, NP)的结构及功能，NP与GP不同片段嵌合基因(G1S0. 7、G2S0. 7)的构建及其表达，以及不同融合基因(蛋白)刺激机体免疫应答的能力及其影响因素等进行了较为深入的研究。一系列体内、外实验结果表明，上述嵌合基因在腺病毒表达系统中能有效地刺激机体的体液免疫(包括中和抗体)应答以及细胞免疫应答，且其效果均高于非嵌合组。
然而在研究中我们也发现了ー些问题，如尽管利用各种系统均能表达出完整的融合蛋白，但总的来说蛋白表达量还是偏低。此外，用融合蛋白免疫动物后虽然各表达系统均能刺激机体产生体液及细胞免疫应答，且腺病毒表达系统的效果要优于其他系统，但是整体的免疫水平还不十分理想。因此，进ー步选择合适的表达载体、优化表达系统对目前HFRS基因工程疫苗的研究有着重要的意义。本申请人前期对含嵌合基因G2S0. 7的重组腺病毒转移载体G2S0. 7-pShuttle进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子，得到含CAG启动子/增强子的汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7的重组腺病毒转移载体，命名为G2S0. 7-pCAG，整合入腺病毒载体DNA中，得到重组腺病毒rAd-G2S0. 7-pCAG。通过比较表达融合蛋白G2S0. 7，结果显示该重组腺病毒与未替换启动子的原重组腺病毒rAd-G2S0. 7相比，能有效提高融合蛋白G2S0. 7的表达。在此基础上，本发明将HSP70抗原递呈分子基因C末端(HSP70 359_610aa)连接到该重组转移载体上，通过双酶切，进而将重组片段整合入腺病毒载体DNA中，得到能够促进汉坦病韋融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病韋闻表达载体。
优化腺病毒表达载体，促进机体对抗原的提呈促进疫苗组份在体内的有效提呈是提高HFRS基因工程疫苗的效率的途径之一。HSP70因其在抗原提呈和分子伴侶方面的突出优势引起了研究者的重视。热休克蛋白(heatshock protein, HSP)是ー组生物体内普遍存在、进化上高度保守、具有重要生理功能的蛋白质家族，是生物在应激条件下产生的ー种非特异性、能增强机体对高低温、创伤、细菌和病毒感染等适应能力的防御性产物。HSP的主要生理功能是促进与維持新生多肽链的正确折叠，并且调节细胞的生长、分裂、分化、死亡。由于HSP參与蛋白质的转运、折叠和装配，所以HSP又被称为“分子伴侶”。根据分子量的大小和同源程度将HSP分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP等几个家族。HSP70家族广泛存在于各个亚细胞结构中。HSP70家族的结构分为3部分N端(44kDa)由4个α螺旋形成一个裂缝，比C端具有更高的保守性，它具有ATP酶活性，类似肌动蛋白ATP酶结构域；18kDa部分，由4个反向平行的β折叠和ー个α螺旋构成，是多肽的结合部位；C端(IOkDa)主要由α螺旋构成，是多肽和蛋白质·结合的部位，不同HSP70分子该部分的同源性较低。研究表明，HSP70家族蛋白基因与MHC分子基因类似，HSP70的蛋白结合基序与MHC-I类分子的构槽样结构非常相似，是ー种重要的分子伴侶，參与蛋白在细胞内的转运，可作为抗原提呈分子发挥作用。此外，HSP70本身也具有很强的免疫原性，可以作为一种佐剂，強烈地刺激机体免疫系统产生针对抗原的免疫反应，而不再需要其他的免疫佐剂。有研究认为HSP融合蛋白疫苗可能通过HSP的的分子伴侶作用将融合蛋白转移进入APC细胞内，进入MHC-I类分子递呈途径，从而将抗原表位递呈到APC表面，在HIV-lp24与HSP70的融合蛋白的研究中，HSP70能够增强HIV_lp24的免疫原性，激活机体的细胞和体液免疫反应，同时截短的HSP70完全可以替代HSP70独立行使其佐剂功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病毒高表达载体G2S0. 7-pCAG，能有效提高融合蛋白G2S0. 7在实验动物体内的提呈效率，进而提高机体的体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平。将本申请人前期构建的含汉坦病毒76-118株的G2S0. 7嵌合基因及CAG启动子/增强子的重组腺病毒转移载体G2S0. 7-pCAG进行改建，将HSP70抗原递呈分子基因C末端连接到该载体上，并整合入腺病毒载体DNA，以获得一种用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病毒高表达载体。本发明的技术方案是设计ー种用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病毒高表达载体G2S0. 7-pCAG，其制备方法是对含嵌合基因G2S0. 7的重组腺病毒转移载体G2S0. 7-pCAG进行改建，将HSP70抗原递呈分子基因C末端HSP70 359_610aa连接到该载体上，命名为G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列为SEQ ID N0:1所示。本发明目的是通过以下方式实现的对含嵌合基因G2S0. 7的重组腺病毒转移载体pCAG-G2S0. 7进行改建，将HSP70抗原递呈分子基因C末端(HSP70359_610aa)连接到该载体上，得到改建的重组腺病毒转移载体，命名为G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列为SEQ ID NO: I所示。对重组转移载体和腺病毒载体双酶切，将G2S0. 7-pCAG-HSP70C整合入腺病毒载体DNA，得到重组腺病毒载体rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C。
本发明利用基因重组技术，将本申请人前期构建的含汉坦病毒76-118株的G2S0. 7的嵌合基因及CAG启动子/增强子的重组腺病毒转移载体PCAG-G2S0. 7进行改建，并将重组片段整合入腺病毒载体DNA中，以期获得一种用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病毒高表达载体。将本发明rAd-G2S0. 7-pCAG-HSP70C及前期未整合HSP70抗原递呈分子基因C末端的重组腺病毒rAd-G2S0. 7-pCAG和未替换启动子的重组腺病毒rAd-G2S0. 7分别免疫实验小鼠后进行免疫学特性的研究，发现本发明能有效提高融合蛋白G2S0. 7在实验动物体内的提呈效率，进而提高机体的体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平。
下面结合实施例附图对本发明做进ー步说明图 I. HSP70C 基因的 PCR 扩增结果；其中L HSP70C ；M =DNAwide range maker ；
图2. G2S0. 7-pCAG-HSP70C KpnI 单酶切鉴定結果；其中L2 :G2S0. 7-pCAG-HSP70C ；M DL2000maker ；图3.重组腺病毒 DNA 的 PCR 鉴定；其中L2 G2S0. 7-pCAG_HSP70C ；M 200bpmaker。图4.重组腺病毒的 PCR 鉴定；其中L G2S0. 7-pCAG_HSP70C ；M 200bp maker。图5· HEK293细胞的CPE现象；其中A :正常对照；B :转染6天后。图6. G2S0. 7-pCAG-HSP70C表达产物的免疫荧光检测结果；其中A :检测NP的表达；B :检测HSP70C的表达；C HEK 293阴性对照；图7.各组免疫小鼠细胞因子IFN-Y的检测结果；图8.各组免疫小鼠细胞因子IL-2的检测結果。图9.含G2S0. 7嵌合基因的重组腺病毒免疫小鼠CTL检测結果。
具体实施例方式本发明所用的腺病毒表达系统购自CL0NTECH公司的Adeno-X 系统(货号K1650-1)，其转移载体为pShuttle。本发明中所采用的重组腺病毒转移载体G2S0. 7-pCAG由本申请人前期构建(见原专利申请号 200910254563. 2)。本发明中所采用的重组腺病毒rAd-G2S0. 7-pCAG、rAd_G2S0. 7由本申请人前期包
装、纯化。本发明中所采用的双价HFRS灭活疫苗购自浙江天元公司。本发明中所插入HSP70C 基因序列是以 HSP70C up primer、HSP70C down primer为引物，以结核分枝杆菌基因组为模板，进行PCR扩增，如附图I所示。PCR产物与T-easy载体14°C连接过夜，连接产物电转化E. coli JM109后涂布含Amp抗性的琼脂平板，37°C培养12hr,挑选单菌落增菌,提质粒后以HSP70C up primer、HSP70C down primer为引物进行PCR鉴定，获得阳性克隆，命名为Teasy-HSP70C，送金斯瑞生物科技公司进行测序。本发明中重组腺病毒载体构建方法及重组腺病毒免疫学特性的研究内容具体如下
I.重组转移载体G2S0. 7-pCAG-HSP70C的构建采用Not I单酶切G2S0. 7-pCAG和T easy-HSP70C质粒，分别胶回收目的片段和载体。将载体与片段14°C连接过夜，连接产物电转化E. coli JM109后涂布含Kana+抗性的2XYT琼脂平板，37°C培养12hr，挑取单菌落增菌，提质粒后用Kpn I单酶切鉴定，获得阳性克隆，命名为G2S0. 7-pCAG_HSP70C(HSP70C基因位于G2S0. 7嵌合基因的下游)。附图2为G2S0. 7-pCAG_HSP70C阳性克隆Kpn I单酶切鉴定結果。2.重组腺病毒DNArAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C的构建、鉴定、包装及单斑纯化将上述构建成功的重组转移载体和重组腺病毒载体分别用PI-Sce I和I-Ceu I双酶切，胶回收目的片段和载体，T4连接酶14°C连接过 夜，连接产物转化(JM109感受态)后涂布含AMP+的2XYT固体培养基，37°C孵箱培养12 14hr，挑选单菌落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆。附图3为rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C重组腺病毒DNA的PCR鉴定結果。将重组腺病毒DNA用Pac I酶单切以线性化质粒，转染HEK293细胞，待出现明显CPE(CytopathicEffect，细胞病变)后回收细胞，如附图5所示。离心后将沉淀重悬于高压灭菌的PBS。反复冻融该沉淀3次后离心收集上清，即获得重组腺病毒。附图4为rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C的PCR鉴定結果。采用空斑法纯化重组腺病毒，_80°C保存。3. rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C融合蛋白G2S0. 7表达的检测测定重组腺病毒滴度(具体方法參见 CLONTECH Adeno-Xw Rapid Titer Kit，Cat. No. 631028)。以 100pfu/cell的MOI (multiplicity of infection,感染复数)感染293细胞，同时感染本申请人前期包装的rAd-G2S0. 7重组腺病毒作为对照，48hr后免疫荧光检测目的蛋白的表达。3. INP表达的检测感染前24hr以I X IO5细胞/孔的密度将HEK293细胞铺于24孔板，第二天以100pfu/cell的MOI感染HEK293细胞，4hr后更换新鲜的10% S-DMEM培养液，每孔500 μし将细胞置于CO2孵箱中培养48hr，使细胞密度达到75%，之后用冷甲醇_20°C固定细胞20min，PBS轻柔冲洗3次。加入I : 1000稀释的mAb 1A8 (由本申请人制备并保存，可识别汉坦病毒特异抗原位点，具有较高的结合活性)，37°C孵育2hr，PBS轻柔洗3次，加入用O. 2%。伊文氏兰液I : 100稀释的FITC标记的羊抗鼠ニ抗，于37°C孵育lhr，PBS轻柔洗3次。避光保存，在荧光倒置显微镜下观察結果。3. 2HSP70C表达的检测于24孔板中培养细胞及感染病毒步骤如前，以I : 250稀释商品化特异性抗HSP70C抗体，37°C孵育lhr，PBS轻柔冲洗3次后加入用0. 2%。伊文氏兰液I : 100稀释的FITC标记的羊抗鼠ニ抗，于37°C孵育lh，PBS轻柔洗3次，避光保存，在荧光倒置显微镜下观察結果。附图6分别为rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C中融合蛋白G2S0. 7及HSP70C的免疫荧光检测結果。其中A为S0. 7免疫荧光检测結果，B为HSP70C免疫荧光检测結果，C为HEK293细胞阴性对照。4.重组腺病毒免疫C57BL/6小鼠将各组重组腺病毒经过増殖、纯化和滴度測定后，以108pfu/0. 5ml/只经腹腔注射入小鼠体内(4周龄C57BL/6小鼠雌鼠，每组5只，购自本校动物实验中心)，间隔2周免疫一次，共三次；正常小鼠组(4周龄C57BL/6小鼠雌鼠，姆组5只,购自本校动物实验中心)腹腔注射生理盐水0. 5ml/只,Adenovirus组(4周龄C57BL/6小鼠雌鼠，每组5只，购自本校动物实验中心；Adenovirus购自Clotech公司，含IacZ基因，通过检测β_半乳糖苷酶的表达，可作为腺病毒阴性对照)腹腔注射腺病毒108pfu/ml/只，灭活疫苗组腹腔注射疫苗10 μ I/只，间隔2周注射一次，共三次。5.重组腺病毒免疫小鼠血清特异性抗体的检测结果在第三次免疫后10天对各组免疫小鼠摘眼球取血并分离血清。包被HTNV NP lOyg/mlJt过夜；将各组免疫小鼠血清做I : 10 I : 640倍比稀释，疫苗对照组稀释至I : 640，37°C孵育Ihr ;洗涤后各孔加入I : 20000稀释的HRP-抗鼠ニ抗，37°C孵育Ihr ;洗涤后加入OPD底物液显色，室温下避光放置15min后加入終止液，測定各孔的A49tl值。附表I为各组免疫小鼠血清特异性抗体检测結果。
6.重组腺病毒免疫小鼠血清中和抗体的检测结果在第三次免疫后10天对各组免疫小鼠摘眼球取血并分离血清。感染前一天接种Vero-E6细胞于96孔板，使其长成单层。O. 22μπι滤器提前过滤各组免疫小鼠的血清，然后用高压过的IXPBS做I : 5 I 160倍比稀释，阳性对照mAb 3G1 (可识别NP/G2上特异抗原位点，具有较高中和活性和血凝抑制活性)从I : 1000开始做倍比稀释，阴性对照Sp2/0腹水做I : 1000稀释。将iootcid50htnv分别与各实验组血清及对照样品充分混匀，37°c 5% co2孵育lhr。将96孔板各孔细胞上清吸尽，分别加入各组病毒与血清(或腹水)混和液100μ I/孔，做4个复孔，同时设立病毒对照组和正常细胞对照组。37°c 5% CO2孵育90min后，吸尽各孔上清，加入200μ I/孔含2%小牛血清的完全RPM-1640培养液，37°C 5% CO2孵育9天，每隔3天换ー次培养液。将96孔板放入_80°C反复冻融3次，用ELISA夹心法检测冻融液中的病毒抗原，具体步骤如下I 1000稀释mAb 1A8及腹水Sp2/0，4°C包被过夜I加入100 μ I/孔细胞冻融上清，37°C孵育IhI加入I : 2000稀释的HRP-1A8抗体，37°C孵育IhI加入100 μ I/孔OPD底物液显色，静置15minI加入50 μ I/孔2Μ H2SO4终止液I测定各孔A49tl值结果判定Ρ值为各免疫组Α·值，N为阴性对照组A49tl值，以Ρ/Ν值彡2. I者为阳性，能抑制50%细胞感染的血清最大稀释度为中和抗体效价。附表2为各组免疫小鼠血清中和抗体效价检测結果。7.重组腺病毒免疫小鼠分泌细胞因子的ELISPOT检测结果7. I免疫小鼠脾淋巴细胞制备在第三次免疫后10天摘眼球处死各组小鼠，无菌分离脾脏获取脾细胞悬液。加入Gey’ s溶液裂解其中的红细胞，离心收集脾淋巴细胞，加入不完全RPM-1640洗涤2次，离心后重悬于含2%小牛血清完全RPM-1640培养液中，计数备用。7. 2ELISP0T检测免疫小鼠细胞因子IFN- Y、IL-2
处死小鼠前一天，包被IL-2检测板(IFN- Y为预包被检测板)，具体程序如下 无菌条件下每孔加入50 μ I/孔70%こ醇，静置2min后弃尽，加入200 μ I/孔无菌去离子水洗涤5次，100 μ I/孔加入特异性稀释抗体，4°C包被过夜。用无菌I XPBS洗涤5次后，200 μ I/孔加入含10% -小牛血清的完全RPM-1640培养液室温封闭30min，用无菌IXPBS洗涤5次后，包被完成备用。上述各组实验小鼠脾细胞稀释成I X IO7细胞/ml浓度，100 μ I/孔加入个细胞因子检测板，并加入10mg/ml HTNVNP作为刺激物，每个样品作3个复孔。阳性对照孔中加入PHA (phytohemagglutinin,植物血凝素，终浓度为4 μ g/ml),阴性对照孔不加刺激物，背景对照孔只加培养基。37°C 5% CO2孵育18hr，无菌I X PBS洗涤5次后加入生物素化抗鼠细胞因子的mAb，室温孵育2hr，无菌I XPBS洗涤5次后加入I : 1000稀释的HR标记链霉亲和素，室温孵育lhr，高压I XPBS洗涤5次后加入TMB底物显色液，避光静置，待斑点出现后，自来水冲洗，避光明干，用ELISPOT读数仪測定斑点数。附图7为重组腺病毒细胞因子IFN- Y的检测结果ΓΡ < O. 01)。附图8为重组腺病毒 细胞因子IL-2的检测结果(*P < O. 05，**P < O. 01)。8.重组腺病毒免疫小鼠CTL细胞杀伤实验检测结果8. I效应细胞的制备在第3次免疫后10天摘眼球处死各组小鼠，无菌分离脾脏获取脾细胞悬液(同上)，将其置于含5%小牛血清完全RIPM-1640培养液中，加入终浓度为10 μ g/ml的HTNVGP，25U/ml的IL_2，37°C 5% CO2，作为CTL细胞杀伤实验效应细胞。8. 2靶细胞的制备提前两天用重组腺病毒rAd_G2S0. 7感染B16细胞作为CTL细胞杀伤实验靶细胞。8. 3CTL细胞杀伤实验计数效应细胞和靶细胞，按照20 1,50 UlOO I的效靶比将50 μ I (2X IO6/孔、I X IO6/孔、4X IO5/孔)效应细胞和50 μ I (2X IO4/孔)革巴细胞加入96孔板中，设置3个复孔，并以正常鼠脾细胞作为阴性对照。布板设各项对照孔(附表3显示各对照孔配制方案)，之后按如下步骤检测37°C 5% CO2孵育细胞4h后，250 Xg室温离心5min，离心前40min靶细胞最大释放孔加入10 μ I/孔裂解液，离心后每孔吸出50 μ I细胞上清至新96孔板，加入50 μ I/孔底物液，室温避光静置30min，加入50 μ I/孔终止液，测定A49tl值，计算杀伤活性。附图9为重组腺病毒免疫小鼠CTL检测结果，在效靶比为100 I时，rAd-G2S0. 7-pCAG-HSP70C组小鼠脾细胞的杀伤活性要高于其他试验组及对照组(P< O. 05) ο在效靶比为50 I时，rAd-G2S0. 7-pCAG-HSP70C组小鼠脾细胞的杀伤活性要高于其他试验组及对照组(P < O. 01)。表I.各组免疫小鼠血清特异性抗体检测结果
权利要求
1.含有热休克蛋白HSP70C的用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7提呈的重组腺病毒表达载体，其制备方法是对含嵌合基因G2S0. 7的重组腺病毒转移载体G2S0. 7-pCAG进行改建，将HSP70抗原递呈分子基因C末端HSP70359-610aa连接到该载体上，命名为G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列为 SEQ ID NO 1 所示。
全文摘要
本发明涉及含有热休克蛋白HSP70C的用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0.7提呈的重组腺病毒表达载体,主要是对含CAG启动子/增强子及汉坦病毒76-118株的G2S0.7的嵌合基因的G2S0.7-pCAG转移载体进行改建，用于促进机体对高表达的汉坦病毒融合蛋白G2S0.7有效提呈。能有效提高实验动物机体的体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平。
文档编号C12N15/861GK102676582SQ20121007088
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者于澜, 吴兴安, 张亮, 张芳琳, 徐志凯, 李凯, 李璞媛, 白文涛, 程林峰 申请人:中国人民解放军第四军医大学