专利名称：可用于检测肌红蛋白的核酸适体、筛选用微流控芯片及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白的检测技术领域，尤其涉及一种蛋白检测用核酸适体、该核酸适体的筛选方法和应用。
背景技术：
肌红蛋白(Myo)是存在于哺乳动物肌红组织中的一种氧集合蛋白，由153个氨基酸残基组成，含有血红素，和血红蛋白同源。在正常情况下以微量形式(男性20 80 Ug/L;女性10 70 y g/L)存在于健康人血清中。当肌肉损伤时,大量的肌红蛋白便会进入到血液中，导致其在血液中的含量急剧上升。心肌肌红蛋白目前已作为早期诊断心肌梗死的标志物。近年来，肌红蛋白和心肌梗死的关系日益受到人们重视。目前，检测肌红蛋白最常规的方法还是利用肌红蛋白的抗原抗体反应。然而，现在基于抗体的检测技术依然存在着一定的局限性。因此，设计一种高亲和力和高特异性的识别肌红蛋白的核酸分子探针为之后优化其检测技术，避免抗体反应所致局限提供了基础。核酸适体(aptamer)，也称为核酸识体或核酸适配子，是经过一种新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化技术(SELEX)筛选得到的，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合靶物质的单链寡聚核苷酸，可以是DNA也可以是RNA，长度一般为25 60个核苷酸。核酸适体探针的出现，打破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的认识，利用核酸结构的多样性，可使核酸适体探针高效、特异地结合各种靶分子。由于核酸适体探针具有易合成、易修饰、易存储等优点，在蛋白质的分析检测、生物传感器、分子开关的开发、医学诊断治疗等方面有很大的应用前景，这也为肌红蛋白的具体检测应用提供了如提和基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有高亲和力和高特异性的可用于检测肌红蛋白的核酸适体，还提供一种基于正反筛集成的微流控芯片及用该芯片筛选前述核酸适体的筛选方法，还提供利用该核酸适体进行肌红蛋白检测的具体应用。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种可用于检测肌红蛋白的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下序列I 序列5中的任意一条序列所示的DNA片段，序列 I 序列 5 被分别命名为 Myo40-7-23、Myo40-7-27、Myo40-7-34、Myo40-7-69 和Myo19-7-34
序列 I Myo40-7-23
5’ - GACATCTATCGCCTCGATTTCCTTTGGTGAGATCGGCTCC-3’ ；
序列 2 Myo40-7-27
5’ - CCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTGCTGCGTTGTTCCGA-3’ ；序列 3 Myo40-7_34
5’ - ACGCACAATTCCTTGTCCAATTAGGAAATTCTACGCGGAT-3’ ；
序列 4 Myo40-7_69
5’ - CGAGTACTTCTTTGCTAGTTCGCGAGATACGTTGGCTAGG-3’ ；
序列 5 Myo 19-7-34
5’ - TTCCTTGTCCAATTAGGAA-3’。 上述的可用于检测肌红蛋白的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。上述的可用于检测肌红蛋白的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上可结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种可用于检测肌红蛋白的核酸适体衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种
(1)将上述核酸适体任意位置上的碱基A、T、G或C置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；
(2)上述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；
(3)上述核酸适体改造成的肽核酸；
(4)上述核酸适体改造成的锁核酸。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种可用于筛选核酸适体的微流控芯片，所述微流控芯片包括进样口、出样口和连接二者的进样流道，所述进样流道上设有两个收缩段以形成两个狭窄流道，两个收缩段将进样流道分隔成前流道、中流道、后流道三个流段，所述前流道中填充至少上千个表面修饰有反筛蛋白的反筛蛋白修饰微珠以形成反筛单元，所述中流道中填充至少上千个表面修饰有正筛蛋白的正筛蛋白修饰微珠以形成正筛单元，所述反筛蛋白修饰微珠的粒径大于连通所述前流道和中流道的狭窄流道的宽度，所述正筛蛋白修饰微珠的粒径大于连通所述中流道和后流道的狭窄流道的宽度。上述的微流控芯片中，作为进一步的改进，所述微流控芯片上还另设有洗脱液进液口和洗脱液流道，所述洗脱液流道一端连接所述洗脱液进液口，另一端则交汇于所述中流道上使所述洗脱液流道和进样流道连通。上述的微流控芯片中，所述进样流道的宽度优选在150 以上，进样流道的高度优选在50 y m以上。所述收缩段形成的狭窄流道的高度优选为10 y m 18 y m。所述微珠优选聚苯乙烯微珠，所述微珠的粒径优选为20 ii m 40 ii m。上述的微流控芯片中，所述微流控芯片优选为筛选上述核酸适体的微流控芯片，所述反筛蛋白优选包括牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、C反应蛋白(CRP)中的至少一种，所述正筛蛋白为肌红蛋白。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用上述的微流控芯片筛选上述核酸适体的筛选方法，包括以下步骤
(I)优化核酸文库将预先设定的起始核酸文库、与两端PCR引物序列互补的短序列分别孵育，将引物序列进行封闭以避免参与到与肌红蛋白结合时形成的二级结构中；所述起始核酸文库为 5’ - fam-gacaggcaggacaccgtaac-n40-ctgctacctccctcctcttc - 3’(容量优选在IO14以上)，所述与两端PCR引物序列互补的短序列为引物 RP-Biotin :5’ - Biotin-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG - 3，；
引物 FP-C :5’ - GTTACGGTGTCCTGCCTGTC - 3，；
(2)初筛将所述起始核酸文库的溶液从所述微流控芯片的进样口注入，使所述起始核酸文库的溶液首先流经所述反筛单元，起始核酸文库中与所述反筛蛋白有亲和力的核酸分子被所述反筛蛋白修饰微珠捕获，剩余核酸文库经狭窄流道流向所述的正筛单元，剩余核酸文库中与所述肌红蛋白有亲和力的部分核酸分子与正筛蛋白修饰微珠上的肌红蛋白结合，然后通过对所述进样流道进行冲洗、洗脱，收集得到与肌红蛋白结合的初筛核酸文库；
(3)纯化将步骤(2)得到的初筛核酸文库进行PCR扩增，扩增产物通过链霉亲和素微珠填充的亲和柱进行分离，再通过碱变性解链、脱盐后形成次一级核酸文库；
(4)循环以上述得到的次一级核酸文库替代所述起始核酸文库并重复上述的步骤 (2) 步骤(3)(每次循环时应当重新在微流控芯片中修饰微珠)，直至得到包含有与肌红蛋白高亲和力和高特异性结合的核酸适体的核酸文库。上述的筛选方法中，所述PCR扩增时用到的引物序列为
引物 FP-FAM :5，- FAM-GACAGGCAGGACACCGTAAC _ 3’ ；
引物 RP-Biotin :5’ - Biotin-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG - 3，；
所述PCR扩增的工艺条件优选为94°C 5min，94°C 30sec,60. 5°C退火30sec，72°C延伸30sec，扩增10个循环，最后72°C延伸7min。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适体或者上述的核酸适体衍生物在识别、检测肌红蛋白或者制备检测肌红蛋白的试剂盒中的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于利用本发明的核酸适体，可以快速、有效地识别肌红蛋白，对其他同源蛋白不具有识别功能。本发明筛选出的核酸适体稳定性好、无毒性、易于修饰，且序列长度较短，有利于之后分子探针的设计。另外，本发明相对于已有的微流控芯片SELEX方法，创造性地将正筛单元和反筛单元集成到一个微流控芯片上，本发明的微流控芯片不仅结构简单，制作方便，而且使正反筛过程能够同时进行，进一步减少了筛选的流程，提高了筛选效率。本发明的以上技术方案将促使核酸适体在肌红蛋白的检测中发挥巨大的作用。
图I为本发明实施例中利用正反筛集成的微流控芯片用于筛选肌红蛋白特异性核酸适体的工艺流程图。图2为本发明实施例中微流控芯片的结构示意图，其中，a表示固定反筛蛋白修饰微珠至第一收缩段；b表示固定肌红蛋白修饰微珠至第二收缩段；c表示通入溶于结合缓冲液的文库流向路径；d表示通入冲洗缓冲液和洗脱缓冲液后的流向路径。图3为本发明实施例的肌红蛋白核酸适体循环筛选过程中检测到的每轮表面等离子共振(SPR)信号的变化图。图4为本发明实施例中筛选出的肌红蛋白的核酸适体在浓度变化时的RU值变化图。图5为本发明实施例中固定序列法检测肌红蛋白在蛋白质浓度变化时的RU值变化图。
图6为本发明实施例中核酸适体对肌红蛋白的特异性的考察结果。图例说明
I、进样口 ；2、出样口 ；3、进样流道；31、前流道；32、中流道；33、后流道；4、狭窄流道；5、反筛蛋白修饰微珠；6、正筛蛋白修饰微珠；7、洗脱液进液口 ；8、洗脱液流道。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。实施例
一种本发明的可用于检测肌红蛋白的核酸适体，该核酸适体的核苷酸序列包括以下序列I 序列5中的任意一条序列所示的DNA片段，序列I 序列5被分别命名为 Myo40-7-23、Myo40-7-27、Myo40-7-34、Myo40-7-69 和 Myol9-7_34
序列 I Myo40-7-23
5’ - GACATCTATCGCCTCGATTTCCTTTGGTGAGATCGGCTCC-3’ ；
序列 2 Myo40-7-27
5’ - CCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTGCTGCGTTGTTCCGA-3’ ；
序列 3 Myo40-7_34
5’ - ACGCACAATTCCTTGTCCAATTAGGAAATTCTACGCGGAT-3’ ；
序列 4 Myo40-7_69
5’ - CGAGTACTTCTTTGCTAGTTCGCGAGATACGTTGGCTAGG-3’ ；
序列 5 Myo 19-7-34
5’ - TTCCTTGTCCAATTAGGAA-3’。本实施例的可用于检测肌红蛋白的核酸适体，其核苷酸序列上的某一位置可以被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化，其核苷酸序列上也可以结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。本实施例的上述核酸适体还可衍生出以下可用于检测肌红蛋白的核酸适体衍生物
(1)将本实施例的核酸适体任意位置上的碱基A、T、G或C置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；
(2)本实施例的核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；
(3)本实施例的核酸适体改造成的肽核酸；
(4)本实施例的核酸适体改造成的锁核酸。一种如图2所示的本发明的可用于筛选核酸适体的微流控芯片，该微流控芯片包括进样口 I、出样口 2和连接进样口 I和出样口 2的进样流道3，进样流道3上设有两个收缩段以形成两个狭窄流道4，两个收缩段将进样流道分隔成前流道31、中流道32、后流道33三个流段，前流道31中填充约8000个表面修饰有反筛蛋白(包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白和C反应蛋白)的反筛蛋白修饰微珠5以形成反筛单元，中流道32中填充约8000个表面修饰有肌红蛋白的正筛蛋白修饰微珠6以形成正筛单元。本实施例的微流控芯片上还另设有洗脱液进液口 7和洗脱液流道8，洗脱液流道8 —端连接洗脱液进液口 7，另一端则交汇于中流道32上使洗脱液流道8和进样流道3连通。本实施例的微流控芯片中，进样流道3的宽度为200 u m,进样流道3的高度为70 y m ;洗脱液流道8的宽度为200 u m,洗脱液流道8的高度为70 ii m ;收缩段形成的狭窄流道4的高度为15 u m。本实施例的微流控芯片为玻璃材质，采用标准的光刻技术、湿法刻蚀和高温键合方式制备。本实施例的微珠(正、反筛蛋白修饰微珠)为聚苯乙烯微珠，微珠的粒径为25 u m。在制作本实施例的微流控芯片时，微珠的修饰通过以下操作实现首先将肌红蛋白和反筛蛋白分别与聚苯乙烯微珠孵育，得到正筛蛋白修饰微珠6和反筛蛋白修饰微珠5，然后将反筛蛋白修饰微珠从进样口 I处置入，使其固定填充于第一收缩段处形成正筛单元；再将正筛蛋白(即肌红蛋白)修饰微珠从洗脱液进液口 7处置入，使其固定填充于第二收缩段处形成正筛单元。如图I所示，一种用本实施例的正反筛单元集成的微流控芯片筛选本实施例的上
述核酸适体的方法，包括以下步骤
I.优化核酸文库
1.I设计起始核酸文库起始核酸文库容量在IO14以上，设计合成两端包含20个核苷酸、中间包含40个核苷酸的随机核酸序列文库如下
5’ - FAM-GACAGGCAGGACACCGTAAC-N4(i-CTGCTACCTCCCTCCTCTTC-3’。I. 2优化起始核酸文库将合成好的I. 34nmol的上述单链起始核酸文库以及I. 5倍量的引物RP-Biotin和引物FP-C溶于结合缓冲液(20mmol/L Hepes, 120mmol/L NaCl,5mmol/L KCl, lmmol/L CaCl2,1 mmol/L MgCl2,pH 7. 35)中，于 95°C变性 5 min 后缓慢冷却至室温。引物RP-Biotin :5’ - Biotin-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG - 3’ ；
引物 FP-C :5’ - GTTACGGTGTCCTGCCTGTC - 3，。2.修饰微珠制备微流控芯片
2.I取0. 5mL直径为25 ii m的聚苯乙烯微珠置于I. 5mL离心管中，移走上清，用硼酸缓冲液(0. lmol/L硼酸，pH为8. 5)冲洗3次。2. 2取20ii g 30ii g的肌红蛋白加入步骤2. I的微珠中，25°C过夜孵育，用硼酸缓冲液冲洗2次后加入储存缓冲液(0. lmol/L PBS, 10mg/mL BSA，0. 1% NaN3, 5%甘油，pH为7. 4) 4°C保存。另外分别取10 ii g HSA, BSA, CRP同时加入步骤2. I的微珠中25°C过夜孵育，用硼酸缓冲液冲洗2次后加入储存缓冲液。2. 3准备一如图2所示本实施例的微流控芯片，微流控芯片的进样流道3两端分别设有进样口 I和出样口 2，进样流道3中间设有两个收缩段以形成用于阻挡微珠通过的狭窄流道4 ;将经过步骤2. 2修饰后的反筛蛋白修饰微珠5和正筛蛋白修饰微珠6按图2所示的a b的顺序分别固定于第一、第二收缩段的一端。3.初筛
如图I、图2所示，将步骤I中获得的优化起始核酸文库通入上述微流控芯片的进样流道3内，控制流速0. 5 u L/min (通过微量注射泵控制流速)，起始核酸文库的溶液首先经过反筛单元，其中与反筛蛋白有亲和力的核酸分子由于结合被反筛蛋白修饰微珠5捕获住，剩余核酸文库则流向正筛单元(如图2中的c所示)，其中与肌红蛋白有亲和力的部分核酸分子与正筛蛋白修饰微珠6结合，之后对正筛单元用冲洗缓冲液(结合缓冲液，0.05% Tween20)以流速2 u L/min冲洗30min (如图2中的d所示，冲洗缓冲液从洗脱液进液口 7进入，依次流经洗脱液流道8和中流道32进行冲洗)，最后用洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,4mol/L异硫氰酸胍，lmmol/L DTT, pH为8. 3)以流速2 u L/min冲洗30min (洗脱方法同冲洗缓冲液)，经过冲洗、洗脱后，收集得到与肌红蛋白结合的初筛核酸文库。4.纯化
将步骤3收集的初筛核酸文库中的单链DNA进行PCR反应；
引物 FP-FAM :5，- FAM-GACAGGCAGGACACCGTAAC _ 3’ ；
引物 RP-Biotin :5’ - Biotin-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG - 3，。PCR反应条件如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60. 5°C退火30s，72°C延伸30s，扩增10个循环，最后72°C延伸7min。将PCR扩增后的产物通过预装有链霉亲和素修饰的琼脂糖微珠的亲和柱分离带生物素标记的产物，然后用200mmol/L的NaOH进行解链,经脱盐色谱纯化后用作下一轮筛选的单链次一级核酸文库。5.循环
以步骤(4)得到的次一级核酸文库替代优化核酸文库并重复上述的步骤2 步骤4，在之后的筛选过程中，逐步增大冲洗时的流速来增强筛选强度，并通过SPR仪检测每轮的信号变化来确定筛选终点；从图3所示的检测结果可以看出，随着筛选轮数的增加，在加入相同浓度的筛选产物后，SPR信号也不断的增加，说明每轮的筛选的核酸适体相比前一轮的产物都增加了与肌红蛋白的亲和力；总共进行了 8轮循环，最后得到包含有与肌红蛋白高亲和力和高特异性结合的本实施例核酸适体的核酸文库。最后，对本实施例筛选所得的上述序列的核酸适体与肌红蛋白的解离常数Kd进行测定。采用Biacore X生物分子相互作用仪，以结合缓冲液为工作液，按以下步骤进行
首先以5 ii L/min的流速通入90 y L 20 u M的肌红蛋白修饰于金膜表面，之后以10 y L/min流速通入70 ii L随机ssDNA链进行封闭；处理好之后以10 u L/min流速依次通入各70U L 的一系列浓度(3. 125nM、6. 25nM、12. 5nM、25nM、50nM、100nM、200nM)的筛选所得核酸适体溶液，记录各步骤的RU值的变化。将所得的结果用Sigma Plot软件进行作图，用公式Y=BmaxX/(Kd+X)拟合计算出本实施例五条序列的Kd值，同时以起始文库作为对照，检测结果见图 4，根据上述方程拟合得到 Myo40-7-23、Myo40-7_27、Myo40-7_34、Myo40-7_69、Myol9-7-34这5条序列依次对应的Kd值分别为6. 19±1. 51 nM、3. 20±0. 47 nM、5. 47±0. 65nM、1.92±0. 25 nM和3. 70±0. 27 nM，上述5条序列都对肌红蛋白表现出了高亲和力。利用固定序列法检测肌红蛋白及特异性考察。首先以5 y L/min的流速通入90 y L 0. 05% BSA-Biotin溶液修饰于金膜表面，以同样流速体积通入0. 05% Avidin溶液，之后通入生物素化的核酸适体序列。表面修饰好后，以10 u L/min流速依次通入各70 y L的一系列浓度的肌红蛋白溶液(3. 125 nM、6. 25nM、12. 5 nM、25 nM、50 nMUOO nM、200 nM)，记录各步骤的RU值的变化。将所得的结果用Sigma Plot软件进行作图如图5所示。采用固定序列的方法对各条核酸适体序列的特异性进行了考察，核酸适体修饰好后以10 U L/min流速依次通入各70 u L 500 nM的HSA、BSA、CRP>IgG (人免疫球蛋白G)以及Myo溶液，记录各步骤的RU值的变化如图6所示。结合图 5和图6所示可以看出，通过将筛选出的核酸适体序列固定到金膜表面后，可以有效地捕获溶液中的肌红蛋白，而对其他对照蛋白基本没有信号响应。
权利要求
1.一种可用于检测肌红蛋白的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下序列I 序列5中的任意一条序列所示的DNA片段 序列I :5’ - GACATCTATCGCCTCGATTTCCTTTGGTGAGATCGGCTCC-3’ ； 序列2 5’ - CCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTGCTGCGTTGTTCCGA-3’ ； 序列3 5’ - ACGCACAATTCCTTGTCCAATTAGGAAATTCTACGCGGAT-3’ ； 序列4 5’ - CGAGTACTTCTTTGCTAGTTCGCGAGATACGTTGGCTAGG-3’ ； 序列5 5’ - TTCCTTGTCCAATTAGGAA-3’。
2.根据权利要求I所述的可用于检测肌红蛋白的核酸适体，其特征在于所述核酸适体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
3.根据权利要求I或2所述的可用于检测肌红蛋白的核酸适体，其特征在于所述核酸适体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。
4.一种可用于检测肌红蛋白的核酸适体衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种 (1)将权利要求I或2或3中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、G或C置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物； (2)权利要求I或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； (3)权利要求I或2或3中所述核酸适体改造成的肽核酸； (4)权利要求I或2或3中所述核酸适体改造成的锁核酸。
5.一种可用于筛选核酸适体的微流控芯片，所述微流控芯片包括进样口、出样口和连接二者的进样流道，其特征在于所述进样流道上设有两个收缩段以形成两个狭窄流道，两个收缩段将进样流道分隔成前流道、中流道、后流道三个流段，所述前流道中填充至少上千个表面修饰有反筛蛋白的反筛蛋白修饰微珠以形成反筛单元，所述中流道中填充至少上千个表面修饰有正筛蛋白的正筛蛋白修饰微珠以形成正筛单元，所述反筛蛋白修饰微珠的粒径大于连通所述前流道和中流道的狭窄流道的宽度，所述正筛蛋白修饰微珠的粒径大于连通所述中流道和后流道的狭窄流道的宽度。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片上还另设有洗脱液进液口和洗脱液流道，所述洗脱液流道一端连接所述洗脱液进液口，另一端则交汇于所述中流道上使所述洗脱液流道和进样流道连通。
7.根据权利要求5或6所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片为筛选权利要求I所述的核酸适体的微流控芯片，所述反筛蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、C反应蛋白中的至少一种，所述正筛蛋白为肌红蛋白。
8.一种用权利要求7所述的微流控芯片筛选权利要求I所述核酸适体的筛选方法，包括以下步骤(1)优化核酸文库将预先设定的起始核酸文库、与两端PCR引物序列互补的短序列分别孵育，将引物序列进行封闭；所述起始核酸文库为5’ - fam-gacaggcaggacaccgtaac-n40-ctgctacctccctcctcttc - 3’ ； 所述与两端PCR引物序列互补的短序列为 引物 RP-Biotin :5’ - Biotin-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG - 3，； 引物 FP-C :5’ - GTTACGGTGTCCTGCCTGTC - 3，； (2)初筛将所述起始核酸文库的溶液从所述微流控芯片的进样口注入，使所述起始核酸文库的溶液首先流经所述反筛单元，起始核酸文库中与所述反筛蛋白有亲和力的核酸分子被所述反筛蛋白修饰微珠捕获，剩余核酸文库经狭窄流道流向所述的正筛单元，剩余核酸文库中与所述肌红蛋白有亲和力的部分核酸分子与正筛蛋白修饰微珠上的肌红蛋白结合，然后通过对所述进样流道进行冲洗、洗脱，收集得到与肌红蛋白结合的初筛核酸文库； (3)纯化将步骤(2)得到的初筛核酸文库进行PCR扩增，扩增产物通过链霉亲和素微珠填充的亲和柱进行分离，再通过碱变性解链、脱盐后形成次一级核酸文库； (4)循环以上述得到的次一级核酸文库替代所述起始核酸文库并重复上述的步骤(2) 步骤(3)，直至得到包含有与肌红蛋白高亲和力和高特异性结合的核酸适体的核酸文库。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增时用到的引物序列为 引物 FP-FAM :5，- FAM-GACAGGCAGGACACCGTAAC _ 3’ ； 引物 RP-Biotin :5’ - Biotin-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG - 3，； 所述PCR扩增的工艺条件为94°C 5min，94°C 30sec,60. 5°C退火30sec，72°C延伸30sec，扩增10个循环，最后72°C延伸7min。
10.一种如权利要求I 3中任一项所述的核酸适体或者如权利要求4所述的核酸适体衍生物在识别、检测肌红蛋白或者制备检测肌红蛋白的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可用于检测肌红蛋白的核酸适体及其衍生物，该核酸适体的核苷酸序列包括有本发明序列1～序列5中的任意一条序列所示的DNA片段。本发明公开了一种微流控芯片，包括进样口、出样口和进样流道，进样流道上被两个狭窄流道分隔成前、中、后流道，前流道中填充反筛蛋白修饰微珠，中流道中填充正筛蛋白修饰微，微珠粒径大于狭窄流道的宽度。本发明还公开了一种用前述微流控芯片筛选所述核酸适体的筛选方法，包括优化核酸文库、初筛、纯化、循环几个主要步骤。本发明的检测方法具有高亲和力和高特异性的优点。
文档编号C12N15/115GK102703454SQ20121021499
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者江锐, 王柯敏, 王青, 羊小海, 邢煜骞 申请人:湖南大学