Klk3基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种KLK3基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对G11453A位点的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，针对G7670A位点的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，针对A9367C位点的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16，针对T536C位点的SEQ?ID?NO.17及SEQ?ID?NO.18；和/或针对A15G位点的SEQ?ID?NO.19及SEQ?ID?NO.20；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，能实现多个突变位点的野生型和突变型单独和并行检测。
【专利说明】KLK3基因突变检测特异性引物和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种KLK3基因突变检测特异性引物和液相芯片。 【背景技术】
[0002]血管舒缓素相关肽酶3 (kallikrein-related peptidase3,KLK3),也被称作前列腺特异抗原(prostate-specific antigen, PSA), KLK3 基因位于 19ql3.2_ql3.4,基因全长6KB，含有5个外显子和4个内含子，转录后的mRNA全长1446bp，转录受雄激素调节。KLK3基因是人类组织激肽释放酶基因(KLK)家族成员，是临床上广泛用于筛选、诊断前列腺癌的肿瘤标志物。目前发现PSA在多种组织和体液中表达，精浆中的浓度最丰富。因为PSA具有丝氨酸蛋白酶和类胰凝乳酶活性，特异性降解精浆中的丝氨酸蛋白酶样和糜蛋白酶的特异性底物一精囊蛋白(semenogelin)和纤维连接蛋白(fibronectin),液化精楽;凝块,增加精子的活动力，而且PSA通过其激肽释放酶作用使精液中缓激肽或缓激肽样代谢物增加，缓激肽或缓激肽样物质能诱导平滑肌收缩，使精子活力增加，有利于受精。
[0003]目前，KLK3基因突变检测方法主要有=Illumina光纤微珠芯片技术、SNPlexGenotyping System和荧光定量PCR技术，虽然Illumina光纤微珠芯片技术是高灵敏度和精确性的高通量检测系统，但是自动化程度低，手工操作比较多，难以满足实际应用的需要，SNPlexTM System技术对SNP序列特异性要求较高，不能随意地分型所选择的SNPs，难以应用于临床检测诊断，而且该方法操作比较复杂，不能满足实际应用的需要。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型，同样不能满足实际应用的需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供KLK3基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测KLK3基因五种常见基因型G11453A、G7670A、A9367C、T536C和A15G的野生型和突变型。
[0005]实现上述目的的技术方案如下。
[0006]一种KLK3基因突变检测液相芯片，包括有:
[0007](A).针对KLK3基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对G11453A位点的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，针对G7670A位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，针对 A9367C位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 T536C 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18 ;和 / 或针对 A15G 位点的 SEQ ID N0.19及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ；
[0008](B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.21~SEQ ID N0.30，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0009]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0010]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对G11453A位点的SEQ ID N0.31及SEQID N0.32，针对 G7670A 位点的 SEQ ID N0.33 及 SEQ ID N0.34，针对 A9367C 位点的 SEQ IDN0.35 及 SEQ ID N0.36，针对 T536C 位点的 SEQ ID N0.37 及 SEQ ID N0.38 ;和 / 或针对A15G 位点的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40。
[0011]在其中一个实施例中，所述ASPE弓丨物为:针对G11453A位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.12组成的序列，针对G7670A位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.14组成的序列，针对A9367C位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16组成的序列，针对T536C位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.18组成的序列；和/或针对A15G位点的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.20组成的序列。
[0012]本发明的另一目的是提供用于KLK3基因突变检测的特异性引物。
[0013]具体技术方案如下:
[0014]用于KLK3基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物序列为:针对Gl 1453A位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 G7670A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，针对 A9367C 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 T536C 位点的 SEQ ID N0.17 及SEQ ID N0.18 ;和 / 或针对 A15G 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
[0015]本发明的主要优点在于:
[0016]1.本发明所提供的KLK3基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的KLK3基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0017]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0018]3.本发明的检测方法步骤简单，5种突变位点检测可通过一步PCR即可完成5条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0019]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。【具体实施方式】
[0020]实施例1KLK3基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0021]三、ASPE引物
[0022]针对KLK3基因五种常见基因型G11453A、G7670A、A9367C、T536C和A15G的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1KLK3基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
【权利要求】
1.一种KLK3基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有: (A).针对KLK3基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对G11453A位点的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，针对G7670A位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，针对 A9367C 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 T536C 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18 ;和 / 或针对 A15G 位点的 SEQ ID N0.19及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.21~SEQ ID N0.30，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的KLK3基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为:针对 G11453A 位点的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32，针对 G7670A 位点的 SEQ ID N0.33 及SEQ ID N0.34，针对 A9367C 位点的 SEQ ID N0.35 及 SEQ ID N0.36，针对 T536C 位点的 SEQID N0.37 及 SEQ ID N0.38 ;和 / 或针对 A15G 位点的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40。
3.根据权利要求1或2所述的KLK3基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为:针对G11453A位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.12组成的序列，针对G7670A位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.14组成的序列，针对A9367C位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16组成的序列，针对T536C位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.18组成的序列；和/或针对A15G位点的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQ IDN0.10和SEQ ID N0.20组成的序列。
4.根据权利要求1所述的KLK3基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个 T。
5.用于KLK3基因突变检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为:针对G11453A 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 G7670A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQID N0.14，针对 A9367C 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 T536C 位点的 SEQ IDN0.17 及 SEQ ID N0.18 ;和 / 或针对 A15G 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
【文档编号】C12Q1/68GK103571920SQ201210250251
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月18日 优先权日:2012年7月18日
【发明者】许嘉森, 吴诗扬 申请人:益善生物技术股份有限公司