Sucla2基因突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分离的编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的核酸、分离的多肽、筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法、筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的系统以及用于筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的试剂盒。其中，分离的编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的核酸，与SEQ?ID?NO：1相比，具有c.C308A突变。通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感线粒体DNA耗竭综合征。
【专利说明】SUCLA2基因突变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及SUCLA2基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的核酸、分离的多肽、筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法、筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的系统以及用于筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的试剂盒。
【背景技术】
[0002]线粒体呼吸链复合酶(Multiplemitochondrial respiratory chain, MRC)缺陷是导致线粒体疾病的重要原因，受多种分子遗传机制影响，如线粒体DNA(mtDNA)缺失，线粒体tRNA点突变，线粒体RNA翻译缺陷，线粒体DNA(mtDNA)耗竭，呼吸链亚基组装或调节功能缺陷，线粒体蛋白质输入受损。儿童期发病的线粒体疾病主要由mtDNA耗竭导致(mitochondrial DNA depletion syndromes, MDS1MIM 251880,线粒体 DNA 耗竭综合征)，MDS不同于其他线粒体疾病,它是一数量上出现缺陷的疾病而非质量上的问题,表现为mtDNA拷贝数减少，而线粒体本身数目可能正常，缺失或是增多，导致细胞中呼吸链复合体的合成与ATP合成下降，降低了线粒体的能量代谢功能，为常染色体隐性遗传，具有遗传和临床上的异质性。临床上可分为肝脑病变型、肌肉病变型、其他型如Alpers综合征等三种类型。研究表明，许多核基因编码的基因突变与上述疾病相关。
[0003]然而，现阶段对线粒体DNA耗竭综合征的研究仍有待深入。
【发明内容】
[0004]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出线粒体DNA耗竭综合征·(有时也称为“MDS”)的致病基因上的新突变。
[0005]本发明是基于发明人的下列工作而完成的:发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了线粒体DNA耗竭综合征的致病基因上的新突变(SUCLA2，c.C308A)。
[0006]根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的核酸(即SUCLA2基因突变体)。根据本发明的实施例，该核酸与SEQ ID Ν0:1相t匕，具有C.C308A突变。根据本发明的实施例，发明人确定了 SUCLA2基因突变体，该突变体与MDS的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感线粒体DNA耗竭综合征。
[0007]根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽与SEQ ID N0:2相比，具有p.Alal03Asp突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感线粒体DNA耗竭综合征。
[0008]根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有c.C308A突变是所述生物样品易感线粒体DNA耗竭综合征的指示。通过根据本发明实施例的筛选易感线粒体DNA耗竭综合征(即MDS)的生物样品的方法，可以有效地筛选易感MDS的生物样
品O
[0009]根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括:核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQID NO:1相比，是否具有c.C308A突变，判断所述生物样品是否易感线粒体DNA耗竭综合征。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品。
[0010]根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有:适于检测SUCLA2基因突变体的试剂，其中与SEQ ID N0:1相比，所述SUCLA2基因突变体具有C.C308A突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品。
[0011]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。 【专利附图】
【附图说明】
[0012]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0013]图1显示了根据本发明实施例的筛选易感MDS的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，A为根据本发明实施例的筛选易感MDS的生物样品的系统的示意图，B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；
[0014]图2显示了根据本发明实施例的对患者PI的SUCLA2基因c.C308A突变位点的Sanger测序验证峰图；
[0015]图3显示了根据本发明实施例的对患者PII的SUCLA2基因c.C308A突变位点的Sanger测序验证峰图；以及
[0016]图4和图5分别显示了根据本发明实施例的对患者PI和PII的父母的SUCLA2基因c.C308A突变位点的Sanger测序验证峰图。
【具体实施方式】
[0017]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0018]SUCLA2基因突变体
[0019]根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID Ν0:1相比，该核酸具有C.C308A突变。在本文中所使用的表达方式“编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的核酸”，是指与编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的编码基因(即SUCLA2基因突变体)相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了 SUCLA2基因的突变体，该突变体与线粒体DNA耗竭综合征的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感线粒体DNA耗竭综合征，也可以通过检测该突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感线粒体DNA耗竭综合征。
[0020] 该编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的核酸，是本申请的发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定的线粒体DNA耗竭综合征的致病基因上的新突变。并且，在现有技术中并未见SUCLA2基因上的c.C308A突变与MDS相关的报道。[0021 ] 野生型SUCLA2基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列:
[0022]ATGGCGGCCTCCATGTTCTACGGCAGGCTAGTGGCCGTGGCCACCCTTCGGAACCACCGGCCTCGGACGGCCCAGCGGGCTGCTGCTCAGGTTCTGGGAAGTTCTGGATTGTTTAATAACCATGGACTCCAAGTACAGCAGCAACAGCAAAGGAATCTCTCACTACATGAATACATGAGTATGGAATTATTGCAAGAAGCTGGTGTCTCCGTTCCCAAAGGATATGTGGCAAAGTCACCAGATGAAGCTTATGCAATTGCCAAAAAATTAGGTTCAAAAGATGTCGTGATAAAGGCACAGGTTTTAGCTGGTGGTAGAGGAAAAGGAACATTTGAAAGTGGCCTCAAAGGAGGAGTGAAGATAGTTTTCTCTCCAGAAGAAGCAAAAGCTGTTTCTTCACAAATGATTGGGAAAAAATTGTTTACCAAGCAAACGGGAGAAAAGGGCAGAATATGCAATCAAGTATTGGTCTGTGAGCGAAAATATCCCAGGAGAGAATACTACTTTGCAATAACAATGGAAAGGTCATTTCAAGGTCCTGTATTAATAGGAAGTTCACATGGTGGTGTCAACATTGAAGATGTTGCTGCTGAGTCTCCTGAAGCAATAATTAAAGAACCTATTGATATTGAAGAAGGCATCAAAAAGGAACAAGCTCTCCAGCTTGCACAGAAGATGGGATTTCCACCTAATATTGTGGAATCAGCAGCAGAAAACATGGTCAAGCTTTACAGCCTTTTTCTGAAATACGATGCAACCATGATAGAAATAAATCCAATGGTGGAAGATTCAGATGGAGCTGTATTGTGTATGGATGCAAAGATCAATTTTGACTCTAATTCAGCCTATCGCCAAAAGAAAATCTTTGATCTACAGGACTGGACCCAGGAAGATGAAAGGGACAAAGATGCTGCTAAGGCAAATCTCAACTACATTGGCCTCGATGGAAATATAGGCTGCCTAGTAAATGGTGCTGGTTTGGCTATGGCCACAATGGATATAATAAAACTTCATGGAGGGA`CTCCAGCCAACTTCCTTGATGTTGGTGGTGGTGCTACAGTCCATCAAGTAACAGAAGCATTTAAGCTTATCACTTC`AGATAAAAAGGTACTGGCTATTCTGGTCAACATTTTTGGAGGAATCATGCGCTGTGATGTTATTGCACAGGGTATAGTCATGGCAGTAAAAGACTTGGAAATTAAAATACCTGTTGTGGTACGGTTACAAGGLACACGAGTCGATGATGCLAAGGCACTGATAGCGGACAGTGGACTTAAAATACTTGCTTGTGATGACTTGGATGAAGCTGCTAGAATGGTTGTAAAGCTCTCTGAAATAGTGACCTTAGCGAAGCAAGCACATGTGGATGTGAAATTTCAGTTGCCAATATGACSEQ ID NO:1 )，其编码的琥珀酸辅酶A连接酶的β亚基具有如下所示的氨基酸序列:
[0023]MAASMFYGRLVAVATLRNHRPRTAQRAAAQVLGSSGLFNNHGLQVQQQQQRNLSLHEYMSMELLQEAGVSVPKGYVAKSPDEAYAIAKKLGSKDVVIKAQVLAGGRGKGTFESGLKGGVKIVFSPEEAKAVSSQMIGKKLFTKQTGEKGRICNQVLVCERKYPRREYYFAITMERSFQGPVLIGSSHGGVNIEDVAAESPEAIIKEPIDIEEGIKKEQALQLAQKMGFPPNIVESAAENMVKLYSLFLKYDATMIEINPMVEDSDGAVLCMDAKINFDSNSAYRQKKIFDLQDWTQEDERDKDAAKANLNYIGLDGNIGCLVNGAGLAMATMD11KLHGGTPANFLDVGGGATVHQVTEAFKLIT SDKKVLAILVNIFGGIMRCDVIAQGIVMAVKDLEIKIPVVVRLQGTRVDDAKALIADSGLKILACDDLDEAARMVVKLSEIVTLAKQAHVDVKFQLPI (SEQ ID NO:2)
[0024]发明人发现的SUCLA2基因突变体与SEQ ID NO:1相比，具有c.C308A突变，即相对于野生型SUCLA2基因，本发明的SUCLA2基因突变体的cDNA中第308位的C突变为A，由此，其所编码的产物与野生型琥珀酸辅酶A连接酶的β亚基(SEQ ID NO:2)相比，具有p.Alal03Asp突变，即其103位氨基酸从Ala突变为Asp。
[0025]SUCLA2 (MM:*603921)位于13号染色体，包含11个外显子，编码含463个氨基酸琥珀酸辅酶A连接酶的β亚基，与α亚基通过异二聚化作用形成琥珀酸辅酶A连接酶，参与三羧酸循环过程。该基因突变会导致线粒体DNA耗竭综合征(ΜΜ: 612073)，伴甲基丙二酸尿的线粒体脑肌病。截止到目前，仅有25例携带SUCLA2基因突变的患者被报道，其中大部分来自法罗群岛，为4号内含子的剪接微点G>A纯合突变，导致4号外显子被剪接掉。目前尚未有关于本发明提出的SUCLA2基因的c.C308A突变导致MDS的报道。
[0026]根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID N0:2相比，该分离的多肽具有p.Alal03Asp突变。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的核酸(即SUCLA2基因突变体)编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感线粒体DNA耗竭综合征，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感线粒体DNA耗竭综合征。
[0027]筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法
[0028]根据本发明的 第三方面，本发明提出了一种筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法可以包括以下步骤:
[0029]首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品SUCLA2是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中SUCLA2是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含SUCLA2编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括:从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA ；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的效率。
[0030]接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、SOLiD,454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括:首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自Hiseq2000, S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集SUCLA2外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括:利用SUCLA2基因外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集SUCLA2外显子，从而能够进一步提高筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的效率。根据本发明的实施例，SUCLA2基因外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些SUCLA2基因外显子特异性引物具有SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列。 [0031]发明人惊奇地发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对SUCLA2外显子尤其是c.C308A所在的3号外显子与4号外显子之间的序列的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。
[0032]关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见 Illumina 公司 Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361;Feb 2010)或 Paired-End SamplePrep Guide (Part#1005063 ；Feb2010),通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。
[0033]需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应SUCLA2的编码序列即可。
[0034]最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQID NO:1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有c.C308A突变，则指示生物样品易感线粒体DNA耗竭综合征。由此，通过根据本发明实施例的筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法，可以有效地筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO:1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。
[0035]需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。[0036]筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的系统和试剂盒
[0037]根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法的系统。
[0038]参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的系统1000包括:核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。
[0039]根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本,所得到的cDNA样本构成核酸样本。
[0040]根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括:文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集SUCLA2外显子，进一步提闻筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的效率。由此，文库构建单兀201可以进一步包括PCR扩增模块(图中未示出)，在该PCR扩增模块中设置有SUCLA2基因外显子特异性引物，以便利用SUCLA2基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，SUCLA2基因外显子特异性引物具有如SEQ ID N0:3_4所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进`行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。
[0041]根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1的区别判断生物样品是否易感线粒体DNA耗竭综合征。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0:1相t匕，是否具有c.C308A突变，判断生物样品是否易感线粒体DNA耗竭综合征。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0:1相比，具有C.C308A突变，是生物样品易感线粒体DNA耗竭综合征的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO:1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。
[0042]由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品。
[0043]根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的试剂盒包括:适于检测SUCLA2基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO:1相比，该SUCLA2基因突变体具有c.C308A突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测SUCLA2基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测SUCLA2编码基因的试剂，也可以是检测琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针，由此，可以高效地筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品。
[0044]需要说明的是，在本文前面筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。
[0045]此外，本领域技术人员可以理解，在本文中所使用的术语“核酸序列”，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了描述方便，在本说明书和权利要求书中，多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。具体地，例如，在本文中所使用的表达方式“核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有c.C308A突变是所述生物样品易感线粒体DNA耗竭综合征的指示”，其中所述的“核酸样本的核酸序列”包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测与其互补的另一条链，反之亦然。并且，在本文中，“核酸序列”包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种形式的序列，则意味着另一种形式的序列也被公开。例如，公开了 SUCLA2基因的cDNA序列，实际也就公开了其相应的RNA序列。
[0046]下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
[0047]若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
[0048]实施例1全外显子组测序确定致病基因及突变位点
[0049]1、样本收集:
[0050]发明人收集到一个意大利的近亲结婚家系，父母为表亲结婚，父母均正常，两个女儿患病:
[0051]第一例先症者(PI)主要临床表现为:孕期和产褥期皆未见异常。出生I个月出现肌无力，生长迟缓，体重增加较慢，频繁呕吐。出生8个月时，神经系统检查提示:脑神经检查正常、视觉检查良好；但是近端躯干肌无力，行动迟缓、腱反射亢进；吞咽困难，开始鼻饲。生化检查显示:血浆和脑脊髓液中乳酸盐(分别是3057 μ mol/1,193 μ mol/1)和丙酮酸盐(分别是2262μπι01/1，144μπι01/1)含量升高，短链脂酰肉毒碱轻度升高到20nmol/ml (正常参考值:3.4-10nmol/l)，未进行尿液中甲基丙二尿酸的检测。听性诱发电位测试显示中枢传导异常。脑部MRI检查显示:双侧尾状核和齿状核影像异常(这一点在两岁时做NMR检查得到进一步确诊)。患者出生18个月时，病情持续恶化:肌张力低下，双侧上睑下垂，眼外肌麻痹明显，伴有严重的认知障碍及语言发育障碍。患者多年的营养摄入都依靠鼻饲，7岁时做了经皮胃造瘘术 。虽然患者病情严重，但其脑电图一直正常，并从未出现代谢衰竭。10岁开始，患者逐渐出现多重腱回缩和脊柱侧凸，之后病情逐渐恶化。14岁时临床评估显示:患者生长指标正常，上睑下垂严重，眼外肌完全瘫痪，视觉和触觉反应不佳，弥漫性肌肉萎缩，躯干和四肢肌张力减退，腱反射消失，行动迟缓并表现出肌张力障碍姿态，脊柱侧凸严重。患者15岁时死于肺炎引发呼吸并发症。
[0052]先症者7岁的妹妹(PU)出现完全相同的临床症状:孕期及产褥期未见异常，出生后就表现出明显的弥漫性肌张力减退。2个月出现躯干及四肢肌张力减退，腱反射亢进并表现出肌张力障碍姿态。血浆乳酸盐含量达到3500 μ mol/1，但尿液中的甲基丙二尿酸MMA在正常范围。到I岁时，其体重几乎没有增长，并逐渐出现精神退化。由于反复呕吐，患者需要通过鼻饲进食。14个月时，大脑MRI检查提示双侧尾状核、豆状核、齿状核异常。5岁时，其临床症状与其姐姐当时的症状类似:双侧上睑下垂严重，不完全眼肌瘫痪，四肢麻痹、肌张力障碍，头部不能自控，脊柱侧凸，无代谢衰竭。
[0053]从患者的临床症状初步判定为线粒体疾病，肌活组织检查证实线粒体呼吸链多种酶缺失，主要表现为:PI的复合酶1、II1、IV缺失，以及PII的复合酶Cl、II1、IV、V缺失。接着取患者进行肌肉活检时的组织，抽取其总DNA，分离mtDNA。对整个mtDNA进行了测序，未发现mtDNA基因突变，排除了 mtDNA基因突变致病。接下来采用DNA印迹和Real-TimePCR对mtDNA进行定量分析，两者的结果均显示患者PI和PII的mtDNA耗竭。由此可以推断患者所患疾病为MDS。
[0054]2、全外显子组测序确定致病基因及突变位点
[0055]发明人利用Nimblegen EZ SeqCap44M Kit结合Solexa高通量测序技术对病例PII进行了外显子测序， 具体步骤如下:
[0056]2.1样品制备
[0057]取患者PII皮肤成纤维细胞，利用常规酚-氯仿法抽提抽提基因组DNA，用于高通量测序。利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的0D260/0D280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μ 1，总量不少于30 μ g。
[0058]2.2文库构建及测序
[0059]利用超声波仪(CovarisS2, Massachusetts, USA)将各基因组DNA样本随机打断成200-300bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库(可参见:http://www.1llumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书,通过参照将其全文并入本文)。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与 SureSelect Biotiny lated RNA Library (BAITS)进行杂交富集,再经过 LM-PCR 的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，参照Illumina标准的成簇和测序的protocol进行测序,测序平台为Illumina Hiseq2000,读取长度为90bp,样本的平均测序深度为71.94X。
[0060]2.3变异检测、注释及数据库比较
[0061]利用Illumina basecalling Softwarel.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用S0APaligner/S0AP2 (可参见:Li R, Li Y, KristiansenK，et al，SOAP: short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008，24 (5):713-714 ;Li R，Yu C，Li Y，ea al，S0AP2:an improved ultrafast tool forshort read alignment.Bioinformatics 2009，25 (15): 1966-1967.，通过参照将其全文并入本文)比对到参考基因组Hgl9(snpl32)，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用 SOAPsnp (可参见:Li R, Li Y, Fang X，Yang H, et al, SNP detection for massivelyparallel who I e-genome resequencing.Genome Res2009, 19 (6): 1124-1132.,通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。
[0062]结果，发明人在病例PII中发现有94363个单核苷酸多态性(SNPs)和6733处的插入 / 缺失。随后通过 dbSNP 数据库(http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/proiects/SNP/snpsummary, cgi ).千人因会^[据库(www.lOOOgenomes.0rg/)、HapMap8 )? (http: //hapmap.ncb1.nlm.nih.rov/)等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。去掉同义突变，将剩下的非同义/剪接位点突变和微小插入缺失根据以下特征进行优先选择:(a)根据隐性遗传方式和父母近亲结婚关系，优先考虑纯合突变；(b)与线粒体蛋白数据库MitoCarta进行比较,得到可能或确定定位于线粒体的蛋白。
[0063]2.4纯合子定位
[0064]发明人通过近亲家系纯合子定位分析的生物信息学方法，进一步缩小了候选基因范围，方法如下:选择单个样品中的单核苷酸多态性位点(SNP)和位于公共数据库dbSNP中的位点作为基因标记。杂合标记选取标准:测序深度大于等于10X，30% -70%的reads支持率；纯合标记:测序深度大于等于5X，95%的reads支持率。通过此标准能有效降低测序错误的影响。基因标记选好后，按照每500个标记组成的窗口最多允许2个杂合标记和相邻标记的距离不超过500Kb的标准，大于IM的区域定义为纯合子区域(大于5M的区域认为更可信)。考虑到外显子的长度和分布对分析的影响，只有相邻外显子连接后总长度超过IMb才进行分析，并且相邻外显子的距离不超过500Kb，其余外显子区域仍被保留为候选区域。
[0065]结果，发明人在病例PII中发现约399M的区域定位为纯合子区域，占整个基因组的14.23%。纯合子区域平均值及中位数的长度分别是1.71MB和1.33MB，最终有25个纯合变异位点定位在纯合子区域。其中有2个突变位点位于编码线粒体蛋白质的基因:T0P1MT和SUCLA2。其中，T0P1MT基因编码线粒体拓扑异构酶，T to C错义突变，导致Ile448Met的氨基酸改变；SUCLA2基因 编码琥珀酸辅酶A连接酶的β亚基，308C>A错义突变，导致Alal03Asp的氨基酸改变。UCSC预测该位点位于高度保守的氨基酸残基序列中，突变将导致SUCLA2蛋白的功能受到影响。
[0066]然后，发明人又通过Polyphen、SIFT、Mutpred、Pmut和Panther等软件预测，进一步确认了上述2个突变基因。
[0067]由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，接下来，发明人又利用Sanger测序方法，对这两个基因的突变位点在家系内进行了验证，T0P1MTATA=>ATG突变在PI中是杂合突变，因此被排除。SUCLA2GCT=>GAT在PI和PII中是纯合突变，而在患者父母中为杂合突变，且在 EVS 外显子数据库(http: //evs.gs.Washington.edu/EVS,截至 2012 年 6 月 20 日该数据库包括2203个非裔美国人和4300个欧裔美国人的个体样本)中未发现该突变位点。Sanger测序中，对SUCLA2基因的11个外显子的测序覆盖度均为100%。
[0068]此外，已知，SUCLA2 (MM:*603921)位于13号染色体，包含11个外显子，编码含463个氨基酸琥珀酸辅酶A连接酶的β亚基，与α亚基通过异二聚化作用形成琥珀酸辅酶A连接酶，参与三羧酸循环过程。该基因突变会导致线粒体DNA耗竭综合征(MM: 612073)，伴甲基丙二酸尿的线粒体脑肌病。截止到目前，仅有25例携带SUCLA2基因突变的患者被报道，其中大部分来自法罗群岛，4号内含子的剪接微点G>A纯合突变，导致4号外显子被剪接掉。2005年Elpeleg等首次报道在来自穆斯林的MDS患者中发现SUCLA2基因的纯合indel突变g.32720del43ins5。Ostergaard等2007年报道法罗群岛的10名患者伴有线粒体脑肌病和MMA含量增加的症状，其中仅有I例患者NMR检查出现基底核的异常影像。另一个来自法罗群岛的大家系中，10名患者均有基底核异常影像的症状(18)。后来在3个意大利家系中，发现SUCLA2基因的突变。发明人所研究的家系中患者的症状与意大利家系中患者的症状较为相似。SUCLA2突变导致的典型的症状是尿液中MMA出现异常。而在发明人所研究的家系中，患者PI未进行MMA检测，PII曾在2个月时做过MMA检测，结果显示正常。这与已报道的SUCLA2突变导致的MMA升高不符，因此发明人重新回到临床上去分析。由于患者PI刚好在医院治疗，因此对PI进行了 MMA检测，发现PI中MMA为11 (参考值〈5)，这就与文献中报道的基本一致。
[0069]因此，综上所述，发明人认为本发明找到的SULCA2基因上的c.C308A突变是MDS
的另一致病突变位点。
[0070]实施例2Sanger法测序验证(家系内、家系外、散发等样本验证情况)
[0071]采集家系内的患者PI (2011年取得并保存的其外周血)和PII及其父母的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的0D260/0D280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/ μ I，总量不少于30 μ go
[0072]然后，分别对家系内2名 患者(PI和PII)和2名家系内正常人(患者的父母，他们均未发病)进行检测，针对SUCLA2基因3号和4号外显子之间的序列设计引物，通过PCR扩增、产物纯化、测序的方法获得SUCLA2基因有关序列，并根据序列测定结果属于突变型还是野生型,验证SUCLA2与MDS之间的相关性。具体方法步骤如下:
[0073]1、DNA 提取:
[0074]分别采取2名患者和2名家系内正常人的外周静脉血，按照实施例1的方法提取基因组DNA，分光光度计测定DNA含量。
[0075]2、引物设计及PCR反应
[0076]参考人类基因组序列数据库GRCh37/hgl9设计SUCLA2基因外显子特异性引物，具体见下表。
[0077]a)引物序列:
[0078]
上游引物(5，~ 3’，SEQ ID NO:)|下游引物(5’ ~ 3’，SEQ ID NO:)
CATGCTGCTCCATGCTTCAT(3)CATGCTCATGACATACAAACA (4)
[0079]b)接着，按以下配比分别配置各基因组DNA样本的PCR反应体系:
[0080]
【权利要求】
1.一种分离的编码琥珀酸辅酶A连接酶β亚基突变体的核酸，其特征在于，与SEQ IDNO:1相比，所述核酸具有c.C308A突变， 任选地，所述核酸为DNA。
2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID Ν0:2相比，所述分离的多肽具有p.Alal03Asp 突变， 任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。
3.一种筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的方法，其特征在于，包括以下步骤: 从所述生物样品提取核酸样本； 确定所述核酸样本的核酸序列； 所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0:1相比，具有C.C308A突变是所述生物样品易感线粒体DNA耗竭综合征的指示， 任选地，所述生物样品为选自人体血液、皮肤、毛发和肌肉的至少一种， 任选地，所述核酸样本为全基因组DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述生物样品提取核酸样本进一步包括: 从所述生物样品提取RNA样本，优选所述RNA样本为mRNA ；以及 基于所述RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包括: 针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，任选地，采用选自Hiseq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测序， 任选地,针对所述核酸样本,构建核酸测序文库进一步包括: 利用SUCLA2基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增；以及 针对所得到的扩增产物，构建所述核酸测序文库， 任选地，所述SUCLA2基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO:3_4所示的核苷酸序列。
6.一种筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的系统，其特征在于，包括: 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列； 判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比，是否具有c.C308A突变，判断所述生物样品是否易感线粒体DNA耗竭综合征。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括: RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连,用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括: 文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果， 任选地,所述文库构建单元进一步包括: PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有SUCLA2基因外显子特异性引物，以便利用SUCLA2基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增， 任选地，所述SUCLA2基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO:3_4所示的核苷酸序列， 任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD,454和单分子测序装置的至少一种。
9.一种用于筛选易感线粒体DNA耗竭综合征的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有: 适于检测SUCLA2基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO:1相比，所述SUCLA2基因突变 体具有c.C308A突变。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为核酸探针。
【文档编号】C12Q1/68GK103571854SQ201210249131
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月18日 优先权日:2012年7月18日
【发明者】方明艳, 刘轩竹, 王海荣, 王俊, 汪建, 杨焕明 申请人:深圳华大基因科技有限公司