专利名称：利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，确切地说，涉及利用苜蓿作为生物反应器生产抗菌肽天蚕素 B (Cecropin B，CB)的方法。
背景技术：
抗菌肽(antibacterial peptide,ABP)是广泛存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害，消除体内突变细胞的ー类小分子多肽，由20 60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。天蚕素抗菌肽(cecropins)是第一个被发现目前研究比较清楚的抗菌肽,在动物中广泛存在，是最具潜カ的抗生素替代品之一。天蚕素(cecropins)对革兰氏阳性菌、部分·革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力，构成宿主防御细菌、真菌等入侵的重要分子屏障，而对真菌和真核细胞没有毒性。研究发现，cecropins能够通过抑制大肠杆菌细胞外膜蛋白相关基因的转录，导致细胞的通透性增加，从而抑制细菌生长。cecropins也能通过抑制细胞的呼吸作用杀灭细菌。有些cecropins通过干扰信号传导通路而间接发生，影响病毒基因转录。cecropins可以对烟草花叶病毒(TMV)、疱疹病毒(HSV-I)、I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)的复制全过程进行干扰。目前，抗菌肽要广泛使用，目前还需要解决ー些问题。首先是来源问题。由于昆虫抗菌肽的天然资源有限，化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手段。化学合成肽类，成本较高。而在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物。所以，非常有必要再寻找一条新的、能够降低抗菌肽生产成本的途径。近年来，随着植物分子生物学的飞速发展以及植物遗传分析和遗传工程技术的不断革新，转基因植物在基础研究和生产实践上都具有其重要意义。利用转基因植物作为生物反应器的研究和开发也在快速的发展，近年越来越受到人们的关注。转基因植物生物反应器的研究使植物以极低的费用大量生产外源蛋白，具有极大的商业价值；利用转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白不仅可以大大降低生产成本，而且简化了它们的贮存运输和使用的方式；用植物作为生物反应器，可以使外源基因以农杆菌或植物病毒为载体介导的在其中表达，因为植物体只表达病原菌的部分免疫蛋白，不含致病微生物，对人畜相对较安全，提高了其表达产物的生物安全性。由于紫花苜蓿具有抗逆性强，适应范围广，利用年限长，再生性强的特点，毎年可以收获多次，而且苜蓿本身能固氮，需肥量少，和其他植物相比投入少、生物量大，所以我们能在低成本的情况下大量生产有抑菌活性的蛋白，有利于植物系统表达外源蛋白的产业化发展。目前抗菌肽的实际开发和应用也有了诸多的实例。用途主要集中在养殖、植物抗病和应用剂型等方面。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于表达生产杂合抗菌肽天蚕素B的植物表达载体。ー种植物表达载体，它是在植物表达体pCAMBIA1390中插入了 CaMV35S启动子，命名为pCAMBIA1390R ;在pCAMBIA1390R中插入其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 3、2或I的基因，分别命名为 pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2 和 pCAMBIA1390RCB。—种杂合抗菌妝天香素B的基因，其喊基序列如序列表SEQ ID NO. 3所不；
所述的杂合抗菌肽天蚕素B的基因为人工合成。本发明另ー个目的是，提供ー种转基因植物的生产方法，pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2或pCAMBIA1390RCB通过农杆菌介导，转化至苜蓿中，获得含抗菌肽天蚕素B的转基因苜蓿。 本发明的又ー个目的是，提供ー种利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽B的方法。利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽B的方法，种植上述方法获得的含抗菌肽天蚕素B的转基因苜蓿，提取抗菌肽天蚕素B。本发明提供了抗菌肽天蚕素B (CB)及杂合抗菌肽天蚕素B (CB2、CB3)，在植物表达体 PCAMBIA1390 中插入了 CaMV35S 启动子，命名为 pCAMBIA1390R ;在 pCAMBIA1390R中分别插入CB、CB2、CB3基因，获得植物表达载体pCAMBIA1390RCB、pCAMBIA1390RCB2和pCAMBIA1390RCB3O通过农杆菌介导转化至苜蓿中，获得了转基因苜蓿。通过实验证明，CB、CB2, CB3基因已整合到苜蓿的基因组中，转基因苜蓿对金黄色葡萄球菌、沙门杆菌有抑制活性，而野生型苜蓿没有抑制活性，CB3-基因植株的抑菌活性最高。苜蓿本身就具有抗逆性强、适应范围广、利用年限长、再生性强及每年可以收获多次的特点；而由于转基因苜蓿转入了抗菌肽基因，更加提高了其抗病能力，利用转基因苜蓿作为生物反应器生产抗菌肽天蚕素B，可以更大地降低了生产抗菌肽天蚕素B的成本。
图I为植物表达体pCAMBIA1390R质粒图谱；
图2为植物表达体pCAMBIA1390R-CB结构示意图
图3为pCAMBIA1390R- CB的酶切鉴定电泳图，其中第一泳道为marker，第二泳道为质粒酶切后片段；
图4为植物表达体pCAMBIA1390RCB的PCR鉴定农杆菌阳性克隆图，其中第一泳道为marker ;第二泳道为阴性对照；3_7泳道PCR鉴定LBA4404的菌落。图5为Puc-T-CB2的PCR鉴定农杆菌阳性克隆图，其中第一泳道为marker ;2_3为PCR鉴定LBA4404的菌落
图6是Puc-T-CB2的酶切鉴定电泳图，其中第一泳道为marker，第二，三泳道为质粒酶切后片段；
图7为植物表达体pCAMBIA1390R-CB2结构示意图
图8是pCAMBIA1390R- CB2的酶切鉴定电泳图，其中第一泳道为marker，第二，三泳道为质粒酶切后片段；
图9是pCAMBIA1390R-CB2的PCR鉴定农杆菌阳性克隆图，其中第一泳道为marker ； 1，2为PCR鉴定LBA4404的菌落
图10为植物表达体pCAMBIA1390R-CB3结构示意图
图11是Puc-T-CB3的PCR鉴定农杆菌阳性克隆图，其中第一泳道为marker ; 1，2为PCR鉴定的菌落
图12是Puc-T-CB3的酶切鉴定电泳图，其中第一泳道为marker，第二，三泳道为质粒酶切后片段；
图13是pCAMBIA1390R-CB3的酶切鉴定电泳图，其中第一泳道为marker，第二，三泳道为质粒酶切后片段；
图14是pCAMBIA1390R-CB3的PCR鉴定农杆菌阳性克隆图，其中第一泳道为marker ；1，2为PCR鉴定LBA4404的菌落
图15是潮霉素对苜蓿愈伤组织生长的抗性筛选
图16为PCAMBIAlSgOR-CB1转基因植株PCR检测图，其中第一泳道为marker DL2000 ；第二泳道为为阴性对照；2-5泳道为转基因植株
图17是pCAMBIA1390R-CB2_基因植株的PCR检测图，其中第一泳道为marker，2_5泳道为转化的苜蓿；
图18为pCAMBIA1390R-CB3_基因植株的PCR检测图，其中第一泳道为marker DL2000 ；第二泳道为阳性质粒pCAMBIA1390R-CB3 ;第三泳道为阴性对照；4_7泳道为转基因植株图19为pCAMBIAl 3901^ 转基因植株RT-PCR检测图，其中第一泳道为markerDL2000 ;第二泳道为阳性质粒pCAMBIA1390R-CB3 ;第3泳道为阴性对照，4-11泳道为转基因植株
图20是转基因植株的Southern Blot检测图，其中第一泳道为沿/ dIIIDNA sizemarker，第二泳道为阳性质粒对照；第三泳道为野生型苜蓿基因组；第五泳道为PCAMBIA1390RCB转基因植株.六，七泳道为pCAMBIA1390RCB2转基因植株.ノV，九泳道为pCAMBIA1390RCB3转基因植株
图21是琼脂糖扩散法测抑菌活性检测图，其中A为金黄色葡萄球菌；B为沙门杆菌；I为pCAMBIA1390R-CB转基因植株提取的蛋白；2为pCAMBIA1390R_CB2转基因植株提取的蛋白；3，4为pCAMBIA1390-CB3.基因植株提取的蛋白，其中，3为人工合成的CB3,4为按照同尾酶的的方法串联的CB3; — :为阴性对照。图22为琼脂糖扩散法测抑菌活性检测的抑菌活性柱形图，其中A为金黄色葡萄球菌；B为沙门杆菌；I为PCAMBIA1390R-CB转基因植株提取的蛋白；2为pCAMBIA1390R-CB2转基因植株提取的蛋白；3，4为pCAMBIA1390_CB3转基因植株提取的蛋白，其中，3为人工合成的CB3,4为按照同尾酶的的方法串联的CB3。
具体实施例方式实施例I植物双元表达载体PCAMBIA1390R的构建
PCAMBIA1390R质粒为本实验室构建，是以植物表达载体pCAMBIA1390为基本骨架，用内切与Bgll进行酶切，回收得载体大片段；与体外合成的花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子进行连接，获得了含有CaMV35S启动子的植物表达载体，命名为pCAMBIA1390R。PCAMBIA1390R质粒图谱见图I。
实施例2植物表达载体pCAMBIA1390R-CB构建及转化
I、根据GenBank上登录的CecropinB碱基序列，应用Primer Premier 5. 0软件按照植物偏好密码子将CB碱基序列重新改造，人工合成单基因CB，其碱基序列如序列表SEQ IDNO. I所示。设计引物
PlCGG GGTACC ATGAACTTCGCGAAGATCCT
P2 AAAACTGCAG TCACTTCCCTATTGCTTTAG以人工合成单基因CB模板，PCR扩增。PCR反应条件94. (TC预变性5min，94. (TC变性35s，65. (TC退火35s，72. (TC延伸35s，30个循环，72. (TC后延伸2min，4°C保存至结束。1%琼脂糖凝胶电泳检测条带正确且无非特异性条带后，用PCR清洁回收试剂盒纯化回收，回收单基因CB。将回收的单基因CB片段与Pucl9_T在16°C水浴下过夜连接，连接体系如下
表I连接反应体系
权利要求
1.ー种植物表达载体，它是在植物表达体PCAMBIA1390中插入了 CaMV35S启动子，命名为pCAMBIA1390R ;在pCAMBIA1390R中插入其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 3、2或I的基因，分别命名为 pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2 和 pCAMBIA1390RCB。
2.根据权利要求I所述的ー种植物表达载体，其特征在于所述的表达载体为pCAMBIA1390RCB3o
3.—种杂合抗菌妝天香素B的基因,其喊基序列如序列表SEQ ID NO. 3所不。
4.根椐权利要求3所述的ー种杂合抗菌肽天蚕素B的基因，所述的杂合抗菌肽天蚕素B的基因为人工合成。
5.ー种转基因植物的生产方法，其特征在于权利要求I所述的植物表达载体通过农杆菌介导，转化至苜蓿中，获得含抗菌肽天蚕素B的转基因苜蓿。
6.根据权利要求5所述的ー种转基因植物的生产方法,所述的植物表达载体为权利要求2所述的植物表达载体。
7.利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽B的方法，种植按权利要求5方法获得的含抗菌肽天蚕素B的转基因苜蓿，提取抗菌肽天蚕素B。
全文摘要
本发明公开了一种抗菌肽天蚕素B(CB)及杂合抗菌肽天蚕素B(CB2、CB3)，在植物表达体pCAMBIA1390中插入了CaMV35S启动子，获得pCAMBIA1390R；分别插入CB、CB2、CB3基因，通过农杆菌介导转化至苜蓿中，获得了转基因苜蓿。通过实验证明，CB、CB2、CB3基因已整合到苜蓿的基因组中，转基因苜蓿对金黄色葡萄球菌、沙门杆菌有抑制活性，而野生型苜蓿没有抑制活性，CB3转基因植株的抑菌活性最高。苜蓿本身就具有抗逆性强、适应范围广、利用年限长、再生性强及每年可以收获多次的特点；而由于转基因苜蓿转入了抗菌肽基因，更加提高了其抗病能力，利用转基因苜蓿作为生物反应器生产抗菌肽天蚕素B，可以更大地降低了生产抗菌肽天蚕素B的成本。
文档编号C12N15/82GK102776226SQ20121025425
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者万秋, 刘秀明, 李校堃, 李海燕, 杜淑环 申请人:吉林农业大学, 温州医学院