专利名称：一种l-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术：
L-丙氨酸脱氢酶(L-alanine dehydrogenase, Aid, EC1.4.1.1)是一种以烟酰胺腺嘌呤(NAD)为辅酶的氨基酸脱氢酶。L-丙氨酸脱氢酶可逆催化L-丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸、氨以及NADH。反应如下所示:
L-alanine + NAD+ + H2O <->NH4+ + pyruvate + NADH + H+
L-丙氨酸脱氢酶是参与调节氨基酸和糖代谢的重要酶类，催化反应的产物丙酮酸或L-丙氨酸广泛应用于医药、农药、食品等领域，具有良好的发展前景。如将该酶与丙氨酸消旋酶共同作用，则可将丙酮酸、氨等 最终生成D-丙氨酸。因此，L-丙氨酸脱氢酶在医药、农药及食品等领域具有重要的应用价值。L-丙氨酸脱氢酶广泛存在于微生物之中，最初是由Wiame等人于1955年发现，但直到1990年其编码基因才由Kuroda等人被克隆。目前已经从超嗜热古菌 Archaeoglobus fulgidus,细长聚球藻 Synechococcus elongatus PCC7942,纳豆菌Bacillus subtilis等多个生物体内发现了丙氨酸脱氢酶的存在。自1998年Patrick等人第一次解析了来自于Phormidium Iapideum中丙氨酸脱氢酶的空间结构以来，目前共有来自6个菌株的丙氨酸脱氢酶的晶体结构得到解析，空间结构的解析为深入阐述丙氨酸脱氢酶的催化机理提供了更为便利的条件。极端嗜碱假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus 0F4),是由Guffanti等于1986年首先发现，Takami等进行了分类学上的分析，该菌是严格需氧型、产孢子、革兰氏阳性、运动型杆状细菌，最适生长温度是30°C，在pH 7.5 -11.5
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的条件下生长，最适pH 10.5。基因组序列分析发现，L-丙氨酸脱氢酶基因和丙氨酸消旋酶相邻形成一个操纵子，二者共同作用，可以合成D-丙氨酸。但由于这些酶在微生物中含量少、活性低，用途受到了一定限制。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种酶活力提高的L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白。本发明的目的之二是提供一种L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白的制备方法。本发明的目的是这样实现的。本发明提供的一种L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。本发明还提供编码上述突变体酶蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本发明还提供含有上述基因的载体及宿主细胞。本发明还提供含有上述基因的工程菌。本发明还提供上述突变体酶蛋白的制备方法，包括以下步骤:(1)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列，在与结构已解析同源蛋白的二级结构序列比对的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物对；所述突变引物对为5 ' - TCTTTAACTGCCATCACCAT-3 '和5 '-ATGGTGATGGCAGTTAAAGA-3'；
(2)以携带L-丙氨酸脱氢酶基因的载体为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将含有突变位点的扩增产物连入表达载体中，构建突变质粒；
(3)将上述突变质粒转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达该突变体酶蛋白。制备方法的优选条件:步骤(2)中所述表达载体为pET系列，pUC系列，pT7-7，或pGEX中的任意一种；
步骤(3)中所述工程菌为BL21 (DE3)。本发明进一步提供上述突变体酶蛋白的应用，具体是将突变体酶蛋白用 -2-
于生物法生产丙酮酸或L-丙氨酸及D-丙氨酸。具体地，本发明是从假坚强芽孢杆菌(Bacillus Pseudofirmus)中获得L-丙氨酸脱氢酶基因(NCBI编号:YP_003426902)，根据同源蛋白的二级结构比对结果确定突变位点，通过定点突变技术(site-directed mutagenesis)取代活性中心附近氨基酸位点,将突变体基因片段与PET22b (+)质粒连接，成功构建重组表达质粒pET22b-K73A ;该重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，构建用于突变体酶表达的基因工程菌BL21(DE3)/ pET22b-K73A ；在37°C和1.0mM IPTG条件下获得了较好的表达。以转换数Keat和表观二级速率常数Kcat/Km表示，突变体K73A的酶活较野生型L-丙氨酸脱氢酶得到了提高；突变体的Kcat及Kcat/Km提高的倍数:
权利要求
1.一种L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示
2.一种编码权利要求1所述突变体酶蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
3.一种制备权利要求1所述突变体酶蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列，在与结构已解析同源蛋白的二级结构序列比对的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物对；所述突变引物对为5 ' - TCTTTAACTGCCATCACCAT-3 '和5 '-ATGGTGATGGCAGTTAAAGA-3'； (2)以携带L-丙氨酸脱氢酶基因的载体为模板，使用上述设计的引物，利用快速PCR突变技术，构建73位氨基酸突变的突变质粒； (3)将上述突变质粒转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达该突变体酶蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中载体为pET系列中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中工程菌为BL21(DE3)。
全文摘要
本发明公开了一种L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白及其制备方法。根据同源序列二级结构比对结果，将假坚强芽孢杆菌(Bacilluspseudofirmus)的L-丙氨酸脱氢酶活性中心附近73位赖氨酸通过PCR定点突变为丙氨酸，构建突变体表达载体，通过原核表达及Ni-NTA亲和层析技术纯化得到突变体酶K73A。所获得的突变体酶K73A之比活力是野生型的202%，而其他酶学性质没有变化。突变体酶蛋白对底物L-丙氨酸的转换数Kcat为376.7min-1，对β-NAD+的转换数Kcat为290.1min-1，分别是野生型的2.0和2.1倍。可用于改善生物法生产丙酮酸及L/D-丙氨酸等的生产工艺。
文档编号C12N15/70GK103074309SQ20121033388
公开日2013年5月1日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者鞠建松, 徐书景, 赵宝华, 何广正, 李兵杰 申请人:河北师范大学