发酵法木聚糖酶的一种制备方法
【专利摘要】本发明涉及发酵法木聚糖酶的一种制备方法，首先将从土壤样品中分离的木聚糖酶产生菌株mtr127用低能离子注入和DEs进行诱变，筛选出高酶活菌株MJT36；其次将MJT36孢子悬液进行发酵，发酵后粗酶液经过分级沉淀、疏水层析、凝胶过滤层析、阴离子交换柱层析等技术进行纯化，冷冻干燥后制得木聚糖酶，活性达到100000IU/g以上。本发明选育的菌株遗传性能稳定、产酶活力高、工艺流程合理，提供了一种生产上可行的木聚糖酶的制备方法。
【专利说明】发酵法木聚糖酶的一种制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及高产木聚糖酶菌株的诱变选育及利用该菌株发酵制备高活性木聚糖酶的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]国外对木聚糖酶的研究较早，应用与生产技术已逐渐趋向成熟，细菌、真菌和放线菌木聚糖酶都得到了广泛而深入的关注和研究，并且在1992年就已实现了木聚糖酶的工业化生产。目前，国外对木聚糖酶的研究已达到了分子水平，研究工作主要集中在对微生物木聚糖酶的诱导与调节机理研究，以及酶的提纯、鉴定方法、木聚糖酶基因分子的克隆和表达等。自上世纪七十年代末开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有150多种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。
[0003]我国在·木聚糖酶方面的研究起步较晚，但发展迅速。目前，我国对木聚糖酶的研究大多停留在产酶菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质研究方面，部分课题已涉及木聚糖酶的分子生物学研究、木聚糖酶基因克隆、表达和重组。不同菌株产木聚糖酶的能力存在差异，对木聚糖酶分离提纯工艺开展深入细致的研究，为我国木聚糖酶制剂生成提供新的酶源。上世纪八十年代初期，中国科学院微生物所在张树政院士的带领下，开始了我国对木聚糖酶的早期研究工作，首次从海率曲酶(Aspergillus phoenicis)中纯化得到了四种木聚糖酶:酶1、酶I1、酶III和酶IV，并深入研究了活力较高的组分酶III的酶学性质。山东大学微生物系国家重点实验室研究获得产酸性木聚糖酶的菌株黑曲霉An-76和产碱性木聚糖酶的菌株嗜碱细菌Cb-2，摇床试验产木聚糖酶分别为350u/mL和300u/mL。无锡江南大学早在2000年就已报道:经UV和NTG方法诱变筛选出一株假单细胞菌，命名为WLUN024,发酵初始PH6.5-8.5，发酵最适温度37 °C。
[0004]木聚糖酶的纯化技术与纯度是决定其生产成本及市场竞争力的重要因素。在传统工艺中，微生物产木聚糖酶大部分是通过色谱法得到纯化。虽然色谱法具有较高的分辨率，但多步纯化耗时、回收率低，不适合高纯度木聚糖酶的产业化生产。目前，研究者在研究基于双水相纯化技术(Aqueous Two-Phase System, ATPS)的衍生技术、三相分离体系(Three-phase partitioning, TPP)和扩张床吸附技术(Expanded bed adsorption, EBD)。Aparna等通过TPP纯化Aspergillus niger木聚糖酶,活性回收率达60%,纯化倍数达95倍。Roy等先将Aspergillus niger木聚糖酶用8M尿素/IOOmM 二硫苏糖醇变性,再进行TPP纯化，木聚糖酶达到了 93%的活性回收率和21倍纯化，且实现了该酶变性后的复性。Santos等尝试用扩张床吸附技术纯化木聚糖酶，虽然最大只有21.8%的活性回收率和30倍纯化，但该技术有经济、省时、木聚糖酶发酵液不需沉淀澄清等优点。
[0005]随着基因突变技术和蛋白质高级结构研究技术的进展，大量性质各异的木聚糖酶，尤其是在极端微生物中获得的具有极端性质的木聚糖酶，有望使木聚糖酶的结构与功能研究取得突破性进展。可以预期，在微生物学、生物化学、细胞生物学、分子生物学、动物营养学等学科的协作下，不久的将来，性能更加优良，技术更加成熟，使用更加有效，效益更加明显的木聚糖酶将在饲料、食品、造纸、纺织、医药及能源等领域发挥更大的作用。
[0006]目前，木聚糖酶的工业化生产与广泛应用还受到制约，如应用在纸浆漂白过程中的木聚糖酶需要具有耐高温、耐碱以及分子量低的特性，但绝大多数微生物的木聚糖酶为中低温或偏酸性，在工业应用上收到了很大限制。当前构建木聚糖酶基因工程高产菌至今尚未取得突破性进展，因此，采用传统的物理或化学方法进行诱变育种以及寻找合适的发酵工艺条件，仍然是发酵法生产木聚糖酶和改变其性质应用于工业化生产的重要手段之
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[0007]本发明采用现代诱变育种方法，在短时间内筛选出一株产木聚糖酶酶量高且性能稳定的高产菌株，研究该高产菌株生产木聚糖酶的发酵工艺和分离纯化工艺，为进一步开发和利用木聚糖酶提供科学依据。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种由微生物菌种发酵液产生、分离纯化制备高酶活木聚糖酶的新工艺。
[0009]本发明所述的木聚糖酶的制备方法由如下步骤组成:
[0010]1、高产菌株的选育
[0011]采用低能离子注入和硫酸二乙酯(DES)复合诱变处理从土壤样品中分离的木聚糖酶产生菌株mtr 127。注入离子选择诱变育种常用的N+，注入离子能量为lOKev、15Kev，N+注入量为 5.6 X IO14 ions/cm2、1.12 X IO15 ions/cm2、1.62 X 1015ions/cm2、2.12 X IO15 ions/cm2,2.62X IO15 ions/cm2 共 5 个处理，DES 溶液选择 0.01%,0.05%的浓度。
[0012]2、发酵培养基组分和培养条件的确定
[0013]利用诱变后的高产菌株MJT36(16S rDNA鉴定为类芽孢杆菌)(CGMCC N0.6410)发酵制取木聚糖酶，同时对发酵条件进行优化。麸皮量对酶活的影响:选择1、1.5、2、2.5、3g添加量接菌培养72h，其他条件不变。碳源对酶活的影响:在液体发酵培养基中添加0.1%的葡萄糖、蔗糖、木糖、木聚糖、淀粉接菌培养72h，其他条件不变。氮源对酶活的影响:在液体发酵培养基中添加1%的蛋白胨、草酸铵、酵母粉、硫酸铵、柠檬酸三铵、尿素接菌培养72h，其他条件不变。吐温-80比例对酶活的影响:分别添加0、0.1%,0.2%,0.3%,0.4%Bi温-80，接菌培养72h，其他条件不变。pH对酶活的影响:选择pH为4、5、6、7、8等5个梯度接菌培养72h，其他条件不变。摇瓶装液量对酶活的影响:添加30、40、50、60、70、80mL液体发酵培养基接菌培养72h，其他条件不变。培养时间对酶活的影响:选择60、72、84、96h接菌培养，其他条件不变。
[0014]3、木聚糖酶发酵液的分离纯化
[0015]粗酶液的制备:发酵液4000r/min低温离心15min，收集上清液为粗酶液。硫酸铵沉淀:取IOmL上清液，加入固体硫酸铵边搅拌至饱和度为50%、55%、60%、65%、70%、75%，4°C过夜。于4°C、8000r/min离心15min，收集沉淀，4°C保存备用。疏水层析:用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，加入固体硫酸铵使其终浓度为0.8mol/L，再于8000r/min离心IOmin,上清液加入到用起始缓冲液平衡好的Phenyl-Sepharose CL-4B、Phenyl-Sepharose 6FF>Pheny1-Sepharose 4FF 疏水柱中，依次用含 0.8,0.4 和 0mol/L 硫酸铵缓冲液阶段洗脱(流速0.4?0.6mL/min)，DNS法测定酶活，收集具有酶活性的酶液(I管/lOmin)。凝胶过滤层析:将收集的酶液用硫酸铵按55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %饱和度沉淀酶蛋白，8000r/min于3°C离心15min,将沉淀用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解,力口入到用0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡好的S印hadex G_25、G_50、G-70分子筛柱中，同一缓冲液洗脱(流速0.4?0.6mL/min)和收集(I管/lOmin)，检测酶活，合并具有较高酶活性的洗脱液。阴离子交换层析:将收集的酶液用0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析24h，浓缩后上DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱,用含 O ?0.2mol/L NaCl 的 ρΗ6.8、20mmol/L 憐酸盐缓冲液进行梯度洗脱(流速0.4?0.6mL/min)和分部收集(I管/5min),合并具有较高酶活性的洗脱液。
[0016]洗脱液用S印hadexG-25脱盐、聚乙二醇浓缩，冷冻干燥后制得木聚糖酶。
[0017]本发明选育菌株遗传性能稳定、产酶活力高、工艺流程合理，技术先进可靠，操作简单，总体技术达国际先进水平。
【具体实施方式】
[0018]实施例1发酵法木聚糖酶的一种制备方法，按以下步骤依次进行:
[0019]1、低能离子注入-DES复合诱变
[0020]单孢子悬浮液的制备:取培养成熟的新鲜斜面，加入IOmL无菌水，用接种铲刮下孢子，用玻璃珠将孢子打散后，再用滤纸过滤，即得到单孢子悬浮液，调整孢子浓度为IO6个
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[0021]低能离子注入诱变:取0.1mL孢子悬`液于无菌空平皿中涂均匀，用无菌风吹干。然后放入离子注入机的靶室进行离子注入。注入离子选择诱变育种常用的N+，注入离子能量为 10Kev、15Kev, N+注入量为 5.6X IO14 ions/cm2、l.12X 1015ions/cm2、1.62X IO15 ions/cm2、2.12X IO15 ions/cm2、2.62 X IO15 ions/cm2共5个处理。注入完毕后，用无菌水洗脱，稀释涂平皿，置恒温培养箱中30°C培养60h。等待单菌落生成后，转接于斜面培养基上，每次所挑的单菌落不少于300个。
[0022]DES诱变:按上述方法制备单孢子悬液。选择0.01 %、0.05% DES溶液，然后取等体积的DES溶液和单孢子悬液混和，30°C振荡培养60h后，将处理后的孢子悬液涂布于平皿，30°C培养72h左右，挑取长出的单菌落进行摇瓶初筛、复筛。
[0023]初筛:将经诱变处理过的孢子悬浮液稀释适当倍数后涂布于分离培养基平板上，30°C恒温培养60h后，挑取生长旺盛且透明圈与菌落直径比大者接种斜面培养基。
[0024]复筛:250mL三角瓶中加入50mL液体发酵培养基，pH6.0，灭菌降到室温，将初筛所获菌株接入摇瓶发酵进行复筛，每瓶接1-2环，接种后在30°C、220r/min的摇床中培养84h后，4000r/min将发酵液离心lOmin，采用DNS3，5- 二硝基水杨酸法测定上清液酶活力，与出发菌株作对照，酶活超过出发菌株者为正突变株。筛选出木聚糖酶高产菌株MJT36，并经传代试验表明，该突变菌株连续传6代稳定。
[0025]2、发酵
[0026]将lmLMJT36孢子悬液(IO6个/mL)接入装有50mL产酶培养基(2g麸皮，0.1 %的葡萄糖，I % 的蛋白胨，0.2%吐温-80，0.2% KH2PO4,0.05% MgSO4.7Η20，起始 pH5)的 250mL三角瓶中，振荡培养72h。
[0027]3、酶的分离纯化[0028]发酵液4000r/min低温离心15min，收集上清液为粗酶液。取IOmL上清液，加入固体硫酸铵边搅拌至饱和度为60%,4°C过夜。于4°C、8000r/min离心15min,收集沉淀存备用。用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，加入固体硫酸铵使其终浓度为0.8mol/L,再于8000r/min离心IOmin,上清液加入到用起始缓冲液平衡好的Phenyl-Sepharose6FF疏水柱中，依次用含0.8，0.4和Omol/L硫酸铵缓冲液阶段洗脱(流速0.5mL/min)，DNS法测定酶活，收集具有酶活性的酶液(I管/lOmin)。将收集的酶液用硫酸铵按65%饱和度沉淀酶蛋白，8000r/min于3°C离心15min,将沉淀用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解,加入到用0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡好的G-50分子筛柱中，同一缓冲液洗脱(流速0.5mL/min)和收集(I管/lOmin)，检测酶活，合并具有较高酶活性的洗脱液。将收集的酶液用0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析24h,浓缩后上DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱,用含O?0.2mol/L NaCl的pH6.8、20mmol/L磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱(流速0.5mL/min)和分部收集(I管/5min)，合并具有较高酶活性的洗脱液。
[0029]洗脱液用S印hadexG-25脱盐、聚乙二醇浓缩，冷冻干燥后制得木聚糖酶。
[0030]经测定，木聚糖酶酶活性为100158IU/g。
[0031]实施例2发酵法木聚糖酶的一种制备方法，按以下步骤依次进行:
[0032]1、低能离子注入-DES复合诱变
[0033]同实施例1。
[0034]2、发酵
[0035]将lmLMJT36孢子悬液(IO6个/mL)接入装有60mL产酶培养基(1.5g麸皮，0.1%的木聚糖，I % 的硫酸铵，0.1 % 吐温-80，0.2% KH2PO4,0.05% MgSO4.7Η20，起始 ρΗ6)的 250mL三角瓶中，振荡培养84h。
[0036]3、酶的分离纯化
[0037]发酵液4000r/min低温离心15min，收集上清液为粗酶液。取IOmL上清液，加入固体硫酸铵边搅拌至饱和度为65%,4°C过夜。于4°C、8000r/min离心15min,收集沉淀存备用。用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，加入固体硫酸铵使其终浓度为0.8mol/L,再于8000r/min离心IOmin,上清液加入到用起始缓冲液平衡好的Phenyl-SepharoseCL-4B疏水柱中，依次用含0.8，0.4和Omol/L硫酸铵缓冲液阶段洗脱(流速0.6mL/min)，DNS法测定酶活，收集具有酶活性的酶液(I管/lOmin)。将收集的酶液用硫酸铵按70%饱和度沉淀酶蛋白，8000r/min于3°C离心15min,将沉淀用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解,力口入到用0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡好的G-75分子筛柱中，同一缓冲液洗脱(流速0.6mL/min)和收集(I管/lOmin)，检测酶活，合并具有较高酶活性的洗脱液。将收集的酶液用
0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析24h,浓缩后上DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱,用含O?0.2mol/L NaCl的pH6.8、20mmol/L磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱(流速0.6mL/min)和分部收集(I管/5min)，合并具有较高酶活性的洗脱液。
[0038]洗脱液用S印hadexG-25脱盐、聚乙二醇浓缩，冷冻干燥后制得木聚糖酶。
[0039]经测定，木聚糖酶酶活性为128146IU/g。
[0040]实施例3发酵法木聚糖酶的一种制备方法，按以下步骤依次进行:
[0041]I)低能离子注入-DES复合诱变
[0042]同实施例1。[0043]2)发酵
[0044]将lmLMJT36孢子悬液(IO6个/mL)接入装有70mL产酶培养基(2.5g麸皮，0.1 %的蔗糖，I % 的酵母粉，0.2% 吐温-80，0.2% KH2PO4,0.05% MgSO4.7Η20，起始 ρΗ8)的 250mL三角瓶中，振荡培养96h。
[0045]3)酶的分离纯化
[0046]发酵液4000r/min低温离心15min，收集上清液为粗酶液。取IOmL上清液，加入固体硫酸铵边搅拌至饱和度为70%，4°C过夜。于4°C、8000r/min离心15min，收集沉淀，4°C保存备用。用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，加入固体硫酸铵使其终浓度为0.8mol/L,再于8000r/min离心IOmin,上清液加入到用起始缓冲液平衡好的Phenyl-Sepharose4FF疏水柱中，依次用含0.8，0.4和Omol/L硫酸铵缓冲液阶段洗脱(流速0.4mL/min)，DNS法测定酶活，收集具有酶活性的酶液(I管/lOmin)。将收集的酶液用硫酸铵按75%饱和度沉淀酶蛋白，8000r/min于3°C离心15min,将沉淀用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解,加入到用0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡好的G-25分子筛柱中，同一缓冲液洗脱(流速0.4mL/min)和收集(I管/lOmin)，检测酶活，合并具有较高酶活性的洗脱液。将收集的酶液用0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析24h,浓缩后上DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱,用含O?
0.2mol/L NaC I的pH6.8、20mmol/L磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱(流速0.4mL/min)和分部收集(I管/5min)，合并具有较高酶活性的洗脱液。
[0047]洗脱液用S印hadexG-25脱盐、聚乙二醇浓缩，冷冻干燥后制得木聚糖酶。
[0048]经测定，木聚 糖酶酶活性为104753IU/g。
【权利要求】
1.发酵法木聚糖酶的一种制备方法，主要包括以下步骤: 1)复合诱变:将从土壤样品中分离的木聚糖酶产生菌株mtrl27用无菌水制成孢子悬浮液，采用低能离子注入和DES进行诱变。经培养后，进行初筛和复筛，最终筛选出高酶活菌株MJT36 (CGMCC N0.6410)，并进行菌种的鉴定，保藏和传代试验。 2)发酵:将MJT36孢子悬液接入装有产酶培养基的三角瓶中，摇瓶振荡培养。 3)酶的分离纯化:①硫酸铵沉淀:发酵液低温离心后收集上清液(粗酶液)，加入固体硫酸铵，过夜后离心，收集沉淀；②疏水层析:用磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，加入固体硫酸铵，离心后上清液加入到用起始缓冲液平衡好的疏水柱中，硫酸铵缓冲液阶段洗脱，收集具有酶活性的酶液凝胶过滤层析:将收集的酶液用硫酸铵沉淀酶蛋白，离心后沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，加入到用磷酸盐缓冲液平衡好的分子筛柱中，同一缓冲液洗脱和收集，检测酶活，合并具有较高酶活性的洗脱液；④阴离子交换层析:将收集的酶液用磷酸盐缓冲液透析，浓缩后上阴离子交换柱，用含NaCl的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱和分部收集，合并具有较高酶活性的洗脱液。 4)冷冻干燥:洗脱液用S印hadexG-25脱盐、聚乙二醇浓缩，冷冻干燥后制得木聚糖酶，活性达到100000IU/g以上。
2.根据权利要求1所述的诱变方法，其特征在于:低能离子注入和DES复合诱变:注入离子选择诱变育种常用的N+，注入离子能量为lOKev、15Kev, N+注入量为5.6 X IO14 ions/cm2、L 12 X IO15 ions/cm2、1.62 X IO15 ions/cm2、2.12 X 1015ions/cm2、2.62 X IO15 ions/cm2共5个处理。DES溶液选择0.01%、0.05% 2个浓度。
3.根据权利要求1所述的发酵条件，其特征在于:将lmLMJT36孢子悬液(IO6 个/mL)接入装有30、40、50、60、70、80mL产酶培养基(1,1.5、2、2.5、3g麸皮，0.1 %的葡萄糖、蔗糖、木糖、木聚糖、淀粉，I %的蛋白胨、草酸铵、酵母粉、硫酸铵、柠檬酸三铵、尿素，0、0.1 %、.0.2%,0.3%,0.4%吐温-80，0.2% KH2PO4j0.05% MgSO4.7Η20，起始ρΗ4、5、6、7、8)的 250mL三角瓶中，振荡培养60、72、84、96h。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于:硫酸铵沉淀后，用磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，加入固体硫酸铵，离心后上清液加入到用起始缓冲液平衡好的Phenyl-Sepharose CL-4B、Phenyl-Sepharose 6FF> Phenyl-Sepharose 4FF 等疏水柱中，硫酸铵缓冲液阶段洗脱(流速0.4?0.6mL/min)。将收集的酶液用硫酸铵按55%、60%、.65%,70%,75%、80%饱和度沉淀酶蛋白，离心后沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，加入到用磷酸盐缓冲液平衡好的Shadex G-25、G_50、G-70分子筛柱中，同一缓冲液洗脱(流速0.4?.0.6mL/min)和收集。将收集的酶液用磷酸盐缓冲液透析，浓缩后上阴离子交换柱，用含NaCl的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱(流速0.4?0.6mL/min)和分部收集，合并具有较高酶活性的洗脱液。
【文档编号】C12N15/01GK103436522SQ201210388616
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年10月15日 优先权日:2012年10月15日
【发明者】李林香, 潘莉 申请人:合肥朗肽生物技术有限公司