专利名称：一种猪伪狂犬病毒的高通量药物筛选的方法
技术领域：
本发明涉及动物传染病防控和动物药物筛选技术领域。更具体涉及一种猪伪狂犬病毒的高通量药物筛选的方法，在药物抑制猪伪狂犬病毒导致的细胞病变基础上，通过测定细胞活力，建立的针对猪伪狂犬病毒的体外药物筛选方法。
背景技术：
猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)所引起的一种以发热、奇痒和脑脊髓炎为主要症状的急性、接触性和高度致死性传染病。该病能引起妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎等，公猪表现睾丸炎、睾丸肿胀萎缩失去种用能力，仔猪表现高热、呼吸困难、流涎、呕吐、腹泻、食欲废绝以及抑郁震颤等症状，继而出现间歇性抽搐、昏迷以致衰竭死亡。伪狂犬病是引起我国猪繁殖疾病的主要原因，在养猪密集的地方可爆发流行。2周龄以内仔猪的发病率和死亡率几乎高达100%，断奶仔猪发病率为20% 40%，死亡率为10% 20%。成年猪感染后，常常继发细菌和病毒感染，加重病程和增加死亡率。猪伪狂犬病已给我国的养猪业造成了严重的经济损失，开发猪伪狂犬病的预防和治疗产品具有重要的经济价值。当前对于猪伪狂犬病的预防主要依赖于疫苗，且目前已成功开发并产业化了多种疫苗。用伪狂犬病毒强毒株经灭活、乳化后制备的灭活疫苗具有安全、免疫期长的优点，但免疫后对机体产生的刺激较大。经异源细胞传代致弱或基因工程改造致弱后，开发的伪狂犬病弱毒疫苗，具有免疫刺激小、免疫效果好的特点，但可能具有毒力返强的危险，近来有使用进口伪狂犬病弱毒疫苗后猪群发病的报道。疫苗都需要一定的免疫期才能产生较好的免疫保护效果，而药物使用后可迅速产生预防和治疗效果。对于猪伪狂犬病毒药物的研究在国内外仍未有报道，也没有可用的药物用于该病的预防和治疗。猪伪狂犬病毒 感染细胞后，可产生明显的细胞病变效应，病变细胞形态改变，活力降低，直至细胞死亡，与无病毒感染的细胞形成鲜明的对照，当化合物对病毒增殖具有抑制活性时，病毒导致的细胞病变效应下降，因此对病毒感染的细胞进行活力测定，可评估伪狂犬病毒在细胞中的增殖状况，进而建立针对猪伪狂犬病毒的药物高通量筛选方法。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种猪伪狂犬病毒的高通量药物筛选的方法，该方法简便、快速、成本低、便于高通量操作，能够针对猪伪狂犬病毒在细胞中增殖的全部过程进行筛选，具有较高的成功率。同时应用该方法筛选到一种抗猪伪狂犬病毒的化合物BVDUji猪伪狂犬病毒强度株具有很好的抑制效果，且对猪伪狂犬病毒活疫苗毒株无抑制效果，是一种理想的抗伪狂犬病毒潜在药物。本发明通过以下技术方案实现:一种猪伪狂犬病毒的高通量药物筛选的方法，其步骤是:
(I)在白色底透96孔细胞板中接种IBRS-2细胞(猪肾细胞系，该细胞系在相关领域长期普遍)，细胞的接种密度为5000个/孔，在37° C 5%C02温箱中培养10-14小时。(2)弃去生长液，在第一孔加入98yL维持液(DMEM中含有1%(ν/ν)牛血清和1%(ν/ν)双抗)，其它孔加入50μ L维持液，再在第一孔加入2μ L待筛选化合物，依次进行倍比稀释，混合均匀后，在每个孔中均加入50 μ L 0.02Μ0Ι的猪伪狂犬病毒鄂A株。在同一块96孔板上，设置未加入病毒和化合物的对照、加入病毒未加化合物的对照。由于化合物均是溶解于二甲亚砜(DMSO)中，因此在所有对照组中加入l%(v/v)DMS0。(3)在 37° C 5%C02 温箱中继续培养 46-50 小时后，加入 IOOyL Celltiter glo试剂(PiOme ga公司)，反应9-11分钟后，在高通量化学发光检测仪中检测，计算化合物的抑制率。(4)化合物抑制率％=(待筛化合物孔的化学发光值-病毒对照组化学发光值的平均值)/ (细胞对照组化学发光值的平均值-病毒对照组化学发光值的平均值)。对不同化合物的抑制率进行计算，得到抑制率较高的化合物作为抗伪狂犬病毒的潜在药物。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:A.本发明中建立的猪伪狂犬病毒药物高通量筛选技术具有准确、直接、易于实现自动化的优点，较传统的MTT法更加准确。同时本发明中的方法还可同时对化合物进行倍比稀释后，测定同一化合物不同浓度下的抗病毒活性，有效提高了命中率。B.本发明中筛选得到的化合物(E)_5_(2-Bromovinyl)_2’ -deoxyuridine (以下简称BVDU)对猪伪狂犬病毒药物的抗病毒效果:通过抗病毒试验测定BVDU对猪伪狂犬病毒抑制的半数有效浓度(EC50)低于1.56μΜ，半数细胞抑制浓度(CC50)为105.1 μ M，BVDU对猪伪狂犬病毒的选择性指数(SI)大于100，可作为理想的抗猪伪狂犬病毒候选药物。同时还发现BVDU对TK基因缺失的弱毒疫苗株的抑制率低于25%，因此BVDU使用后不会影响疫苗的免疫效果。 C.本发明中筛选得到的BVDU对伪狂犬病毒的抑制效果是广谱抗病毒药物利巴韦林的30倍，是疱疹病毒特效药阿昔洛韦的62倍。
图1为不同接种密度下细胞的生长曲线示意图。图中说明细胞在5000个/孔时，其生长与时间成正比。图2为不同细胞接种密度下病毒感染后的细胞生长曲线示意图。图中说明细胞密度为5000个/孔时，接种病毒后，细胞活力与时间成反比。图3为不同剂量的病毒感染后S/B值变化示意图。S/B值为正常细胞中测定的化学发光值+接种病毒细胞中测定的化学发光值。图中说明细胞密度在5000个/孔时，以0.01Μ0Ι接种病毒，S/B值大于10。图4为DMSO对细胞活力的影响示意图。DMSO浓度小于2%时，不影响细胞生长。图5为用高通量筛选技术对48种化合物进行筛选的示意图。对48种化合物进行复筛，其中6种的抑制率大于20%。图6为BVDU对猪伪狂犬病毒野毒株和疫苗毒株的抑制效果示意图。
BVDU对猪伪狂犬病毒野毒的抑制率均>65%，而对TK基因缺失的疫苗株抑制率均〈20%。图7为空斑减少试验检测BVDU对猪伪狂犬病毒的抑制效果示意图。图中Mock组为不加入任何化合物的对照组。BVDU浓度在1.56uM及以上时，可完全抑制伪狂犬病毒的生长。图8为BVDU对细胞的抑制活性检测示意图。图中说明BVDU浓度在IOOuM及以下时，不影响细胞的生长。图9为BVDU结构式示意图。
具体实施例方式实施例1:一种猪伪狂犬病毒的高通量药物筛选的方法，其步骤是:(I)高通量筛选中最佳细胞接种密度和检测终点的确定:为寻找到最佳的细胞接种密度，在96孔细胞培养板上接种IOOyL 5000cells/孔、7500cells/ 孔、lOOOOcells/ 孔、15000cells/ 孔和 20000cells/ 孔，并连续培养至 96h。培养期间每隔24h使用CellTiter glo检测细胞活力。结果显示细胞对照组统计结果显示在72h内细胞活力呈持续增长趋势；72h到96h细胞活力开始下降，表明细胞在培养至96h后已过度生长出现死亡(附图1)。病毒对照组相同条件下培养至96h，每隔24h相同方法检测一次。检测结果显示24h到48h内细胞活力呈持续上升趋势；48h后随着培养时间延长细胞病变逐渐明显，细胞活力 下降(附图2)。其中每孔接种5000cells培养至72h时S/B值为24.U因子为0.68、细胞CV值和病毒CV值分别为9.94%和10%，满足高通量筛选要求。因此选择每孔接种100 μ L 5000cells培养至72h作为检测终点完成后续试验。(2)高通量筛选中病毒感染剂量的确定:用1、0.1、0.01、0.02和0.04个MOIs的病毒接种到IBRS-2细胞中，分别培养至48h和72h后检测细胞活力确定病毒的最佳感染剂量。病毒感染后检测结果M0IS=1、0.1,0.01、
0.02和0.04时48h检测后S/B值分别为6.8,2.7,2.0、1.8和1.4 ；72h检测后S/B值分别为22.7、15.5、11.0、7.5和8.1 (附图3)。通过对48h和72h两个时间点S/B值的分析，结果显示以0.01个MOIs的PRV接种IBRS-2细胞继续培养至72h后S/B值(22.7)达到高通量筛选要求(S/B > 5)。因此，选择0.01个MOIs接种剂量作为后续试验所用病毒感染量。(3)细胞对DMSO的敏感性分析:待筛选的化合物均溶解于DMSO中，为了排除DMSO对IBRS-2细胞活力的影响，将DMSO 接种到 IBRS-2 细胞中，终浓度分别为 2%、1%、0.64%,0.32%,0.16%,0.08%,0.04%,0.02%和0.01%的DMSO接种到IBRS-2细胞中，同时设置未经DMSO处理的细胞对照组，连续培养至72h后检测细胞活力。对检测结果进行统计分析发现DMSO浓度较高(> 1%)时细胞活力与未经DMSO处理的对照组相比显著下降；DMS0浓度彡1%时对细胞活力的影响较小(附图4)。因此，高通量筛选中应保持DMSO浓度彡1%。(4)化合物库筛选:通过对细胞接种密度、检测终点的确定及病毒感染剂量的优化，选择在96孔细胞培养板上接种100 μ L细胞密度为5xl04/mL的IBRS-2细胞对化合物进行筛选。细胞接板后在37°C、5%C02温箱培养24h，弃去旧培养基，换上细胞维持液，同时加入化合物和PRV病毒液继续培养至72h后检测细胞活力并统计结果。选择了 44种化合物进行了该高通量筛选技术的初步应用，在本轮筛选中S/B的平均值为7.23±0.09，细胞对照组变异系数平均值为6.6%±0.8%，病毒对照组变异系数平均值为12.9%±5.8%，V值平均值为0.71±0.01，满足高通量筛选S/B > 5.Z1彡0.5和CV < 10%的要求，表明该筛选技术和试验结果均是稳定可靠的。实施例2:BVDU作为猪伪狂犬病毒的候选药物:(I) BVDU对猪伪狂犬病毒野毒株的抑制效果:将IBRS-2细胞以5000个/孔接种96孔白色底透培养板，12小时后更换为维持液，在维持液中含有0.01M0I的伪狂犬病毒，和不同浓度倍比稀释的BVDU(100 μ M-3.125 μ Μ)，设置细胞对照和病毒对照，继续培养48小时后，加入100 μ L Celltiter glo并测定化学发光值，计算不同浓度的BVDU对伪狂犬病毒的抑制率，发现在BVDU浓度低于3.125 μ M时，抑制率仍大于67.2% (附图6)，说明BVDU对于伪狂犬病毒具有很强的抑制效果。用上述方法对已成功商品化的猪伪狂犬病毒弱毒疫苗株TK-/gG-/gE-毒株进行了抗病毒活性检测，发现BVDU对于该疫苗毒株无任何抑制效果(附图6)，说明BVDU对TK基因缺失的弱毒疫苗毒株不抑制，因此在体内不影响弱毒疫苗的免疫效果。同时用空斑减少试验进一步验证了 BVDU对猪伪狂犬病毒野毒株的抑制效果，将不同浓度倍比稀释的BVDU (50 μ M-0.4 μ M)与猪伪狂犬病毒野毒株混合后，加入在12孔板中铺满单层的细胞，37° C 5%C02培养箱中孵育I小时后，弃去上清液，加入含有相应浓度BVDU的低熔点琼脂糖营养液，继续培养48小时后，对空斑进行计数。设置细胞对照组和病毒对照组。结果发现在BVDU浓度1.56 μ M以上时，可完全抑制猪伪狂犬病毒产生的空斑，抑制率为100%，当BVDU浓度为0.78 μ M时抑制率为86.7%(附图7)。用非线性回归方法计算，BVDU的半数抑制浓度小 于1.56 μ M0同时用空斑试验测定了广谱抗病毒药物利巴韦林(Ribavirin)、人单纯疱疹病毒特效药阿昔洛韦(acyclovir)对猪伪狂犬病毒的抑制效果，发现阿昔洛韦在50 μ M时抑制率为40.1%，在50 μ M以下浓度时对猪伪狂犬病毒无明显抑制活性，利巴韦林在50 μ M抑制率为19.0%，随着化合物浓度的降低，抑制率下降。(2) BVDU对细胞的半数抑制浓度(CC50)将细胞以5000个/孔接种96孔白色底透培养板，12小时后加入不同浓度倍比稀释的BVDU (200 μ Μ-0.78 μ Μ)，设置不加BVDU的对照组，继续培养48小时后，用Celltiterglo测定细胞活力，计算细胞的比活力，用非线性回归的方法预测BVDU对细胞的半数抑制浓度为105.ΙμΜ (附图8)。
权利要求
1.一种猪伪狂犬病毒的高通量药物筛选的方法，其步骤是:(1)在白色底透96孔细胞板中接种IBRS-2细胞，细胞的接种密度为5000个/孔，在37。C 5% C02温箱中培养10-14小时；(2)弃去生长液，在第一孔加入98μ 维持液:DMEM中含有1%ν/ν牛血清和1%ν/ν双抗，其它孔加入50μ 维持液，再在第一孔加入2PL待筛选化合物，依次进行倍比稀释，混合均匀后，在每个孔中均加入50μ 0.02Μ0Ι的猪伪狂犬病毒鄂A株，在同一块96孔板上，设置未加入病毒和化合物的对照、加入病毒未加化合物的对照，化合物均是溶解于二甲亚砜中，在所有对照组中加入1%v/vDMSO ； (3)在37°C 5% C02温箱中继续培养46-50小时后，加入IOOPL Celltiter glo试剂，反应9-11分钟后，在高通量化学发光检测仪中检测，计算化合物的抑制率； (4)化合物抑制率％=待筛化合物孔的化学发光值-病毒对照组化学发光值的平均/细胞对照组化学发光值的平均值-病毒对照组化学发光值的平均值，对不同化合物的抑制率进行计 算，得到抑制率的化合物作为抗伪狂犬病毒的潜在药物。
全文摘要
本发明公开了一种猪伪狂犬病毒的高通量药物筛选的方法，其步骤(1)在白色底透96孔细胞板中接种IBRS-2细胞，在37°C5%CO2温箱中培养；(2)弃去生长液，加入维持液，加入待筛选化合物，依次进行倍比稀释，混合均匀，在每个孔中加入猪伪狂犬病毒鄂A株，在同一块96孔板上，设置未加入病毒和化合物的对照、加入病毒未加化合物的对照，化合物溶解于二甲亚砜中；(3)在37°C5%CO2温箱中继续培养，加入Celltiterglo试剂，在高通量化学发光检测仪中检测，计算化合物的抑制率；(4)具有较高抑制率的化合物作为抗伪狂犬病毒的潜在药物。方法简便、快速、成本低、便于高通量操作，能够针对猪伪狂犬病毒在细胞中增殖的全部过程进行筛选，具有较高的成功率。
文档编号C12Q1/70GK103194543SQ201210416918
公开日2013年7月10日 申请日期2012年10月26日 优先权日2012年10月26日
发明者宋云峰, 周锐, 王翠, 陈焕春 申请人:华中农业大学