专利名称：一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种香菇病毒检测方法，具体涉及一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR弓I物及检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
病毒病是食用菌生产中较为重要的一类病害，与其他病原生物危害不同，其发生具有潜隐性，可能直到某个生长时期才开始显症。香Hentinus edodes (Berk. )sing、是著名的食用菌，其总产量仅次于双孢蘑菇，为世界第二大菇类。我国是香菇栽培的起源地，也是目前全球最大的香菇产销集散地。但随着香菇栽培规模扩大，近年出现不同程度的香菇病毒病危害，香燕感染病毒后菌丝体生长缓慢，长势减弱，子实体畸形，质量和产量严重下降，在湖北、浙江、福建等地曾较大规模的爆发香菇病毒病，给菇农带来惨重经济损失，严 重威胁香菇产业的健康发展。香菇病毒形态多样，大小不同，主要包括球形、杆形和蝌蚪状，以及一些疑似病毒颗粒，其基因组大部分属于dsRNA。以往利用电子显微镜检测病毒，常常会观察到组织中感染了大量的不同形状的病毒颗粒，目的病毒很难被分辨和鉴定。同时由于食用菌病毒通常不显示症状，可能也就不会壳体化，所以必须依赖于检测到可遗传的dsRNA，才能证明它们的存在。在最近十几年中，电子显微镜检测食用菌病毒技术已经逐渐被典型的溴化乙锭荧光染色dsRNA带型的方法所代替。与电子显微镜检测技术相比，dsRNA分析在分辨形态上相似、遗传不同的病毒上以及在分辨病毒和普通细胞成分上具有明显优势，而且dsRNA分析的敏感度更强、诊断更迅速和可靠。脱毒菌株在活力、抗逆性、产量等方面与带毒菌株相比体现明显优势。由于香菇病毒病的研究还比较滞后，目前我们还没有找到比较有效的方法进行防治，因而提供健康的香菇菌种是保证香菇栽培获得高产和稳产的关键。因此建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测方法，为香菇生产提供健康的菌种具有重要的意义，同时为香菇菌种脱毒技术的建立、香菇无病毒品种培育等打下良好的基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物及检测方法，该方法通过设计香菇病毒基因的特异引物，建立香菇病毒的RT-PCR方法，为方便、快速、有效地检测香菇菌种是否带病毒打下基础。本发明首先提供了一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物，如下
正向引物 Ll-S 5’ -ACCGCAATCAATAACT-3’，
反向引物 Ll-A 5’ -AGACAAGATGGAGACG-3’。其次，本发明还提供了一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测方法，首先提取香菇dsRNA,通过反转录成cDNA，然后以反转录的cDNA为模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测，RT-PCR产物大小为852bp。所述RT-PCR检测方法具体包括以下步骤
(I)香菇dsRNA的提取；(2)将提取的香菇dsRNA通过反转录成cDNA:在PCR管中加入10 100 ng/ul dsRNAIulUO umol/L反向引物Ll-A O. 3 O. 5 ul、DEPC水8. 5 8. 8 ul，95 100°C保温5 min,然后迅速放置冰上5 min，再添加 5XRT Buffer 4 ul、10 mmol/L dNTPs O. 5 2 ul、40 U/ul RNA 酶抑制剂 O. 5 ul、100 U/ul 反转录酶 M-MLV O. 3 O. 5 ul、DEPC 水 3 4. 7ul，放置PCR仪上，42°C反应I h，70°C灭活10 min，即得到反转录的cDNA ；
(3)RT-PCR检测以反转录的cDNA为模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测，PCR扩增体系cDNA模板 I 3 ulUOXPCR Buffer 3 ul，含 15 mmol/L MgCl2,2. 5 mmol/L dNTPsI 2.4 ul、10 umol/L 正向引物 Ll-S O. 5 0. 7 ul、10 umol/L 反向引物 Ll-A 0. 5
0.7 ul、5 U/ul Taq DNA 聚合酶 0. 3 0. 6 ul，用 DEPC 水补足至 30 ul ;
PCR 反应条件95°C 5min ；95°C 45second,48. 5°C 45second, 72°C lmin，30 个循环；72 °C IOmin ；
(4)RT-PCR产物的检测结果根据电泳检测的DNA图谱，若扩增出分子量为852bp的 特异DNA条带标记为香菇菌株带有dsRNA病毒，若未扩增出特异DNA条带则表示不携带dsRNA病毒。本发明提供的利用RT-PCR检测香菇病毒的方法，与电镜检测病毒、dsRNA检测病毒和酶学检测病毒相比，具有灵敏度高、检测时间短、检测结果可靠、容易判断、重复性好等优点。具体如下
I、电镜检测病毒时，病毒必须以粒子的形式出现才能被观察到，受时机的限制；此外，分离香菇病毒粒子难度较大，而且需要多种纯化、浓缩设备，以及大型电子显微镜观察，一般的生产、研究单位难以进行。2、王丽等在文献(香菇菌株的dsRNA检测，食用菌学报2009.)中对香菇菌株dsRNA病毒进行了检测，虽然大多供试菌株都检测到dsRNA的存在，但扩增到的dsRNA条带的大小和数量有所不同的。且应用dsRNA检测病毒时，受提取质量和浓度的影响，在dsRNA提取过程中常含有其它的RNA，通过凝胶电泳的检测结果时往往表现出条带不清或缺失，重复性和灵敏度较差。3、酶学检测病毒受酶的性质和提取样品量所限制，此外用同工酶检测病毒时费时又费人力。4、以香菇病毒基因组建立的RT-PCR检测方法，检测时间较短、灵敏度高(检测体系只需要IOng的dsRNA就可清晰检测出，用病毒特有引物进行反转录，增强了特异性和提高检测结果的可靠性)、检测结果可靠、容易判断、重复性好等优点。基因是遗传的物质基础，不易受外界因素等的影响，同时得到的检测图谱具有特异性条带852bp，其显性标记判断一目了然。本发明为香菇生产提供无病毒的菌种，提供可靠的检测方法，并对香菇菌种脱毒技术的建立、香菇无病毒品种培育等方面有较大的应用价值。
图I为使用引物Ll-S与Ll-A检测香菇菌株扩增的DNA图谱，其中M 7为泳道编号；左侧的数字表示DNA片段的分子量，泳道M为DL2000的Mark，泳道I 7为带病毒的香菇菌株，标记片段为852bp。图2为使用引物Ll-S与Ll-A检测香菇菌株扩增的DNA图谱，其中M 13为泳道编号；左侧的数字表示DNA片段的分子量，泳道M为DL2000的Mark，泳道8为带病毒的香燕菌株，标记片段为852bp,泳道9 13为经脱毒后的香燕菌株,未检测到852bp的标记片段。
具体实施例方式RT-PCR检测方法具体包括以下步骤
(1)香菇dsRNA的提取；
(2)将提取的香菇dsRNA通过反转录成cDNA；
以RT反应前的保温温度和RT反应体系中的dsRNA浓度、反向引物浓度、dNTPs浓度、反转录酶M-MLV酶量等为参数,对各参数的RT反应进行逐一优化,得到香燕dsRNA的RT反应体系参数范围如下10 100 ng/ul dsRNA、反向引物O. 15 O. 25 umol/ L、dNTPs 025 I mmol/L、反转录酶M-MLV 2. 5 7. 5 U/ul、保温温度95 100°C。经过优化，能够扩增出·清晰的特异条带。(3)RT_PCR检测以经RT反应得到的cDNA为模板，对PCR扩增体系里的cDNA添加量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、正反向引物浓度、Taq DNA聚合酶酶量等参数进行逐一优化，得到PCR最佳扩增体系的各参数范围是cDNA模板I 4 ul、Mg2+浓度I. 5 2. 5 mmol/L、dNTPs 浓度 O. 12 O. 2 mmol/L、引物浓度 O. 13 O. 23 umol/ L、Taq 酶酶量 0. 07 0. IU/ul.经过优化，能够扩增出清晰的特异条带。为了充分公开本发明的一种香菇病毒的检测方法，以下结合实施例加以说明。实施例I :一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测方法 一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测方法，包括以下步骤
一、香菇病毒RT-PCR检测弓I物的设计
根据已发表的香燕病毒序列edodes mycovirus HKB gene (AB429556. 2),
应用Primer5或其它引物设计软件，得到香菇病毒RT-PCR的检测引物。该引物的特点是对香菇病毒基因有特异扩增位点，得到的片段大小为852bp。香菇病毒RT-PCR引物如下Ll-S 5’ -ACCGCAATCAATAACT-3，，
Ll-A 5，-AGACAAGATGGAGACG -3'二、香菇病毒的dsRNA的提取
对不正常香菇菌种或发生病毒病的香菇菌种(王丽等，香菇菌株的dsRNA检测，食用菌学报2009.)、经脱毒后的香菇菌种进行菌丝培养与收集，提取香菇的dsRNA。(I)香菇菌种菌丝体的培养与收集
1、在无菌操作下，将香菇菌种转接于PDA斜面，25°C恒温培养13d-15d；
2、在无菌操作下，用接种耙耙碎转接好的香菇菌种，转接入250ml三角瓶，含100 mlPDA液体培养基中；
3、放在25°C恒温箱静置培养20d-25d ；
4、戴上一次性手套，把三角瓶中培养好的香菇菌丝体，倒入两层纱布中过滤，用镊子或钥匙挑除未消耗的琼脂块，无菌水冲洗，滤纸吸干；
5、称取0.5 Ig菌丝，用滤纸包好，直接用来提取病毒dsRNA或_20°C保存备用。(2 )香菇的dsRNA提取I、把收集好的香菇菌丝放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末；
余下步骤参考文献(郭灵芳，张长青，鲁红学，等.一种简单快速的食用菌病毒dsRNA提取方法[J].实验技术与管理，2010，27 (12) :51 53，57.)
三、RT-PCR检测建立
提取的香菇dsRNA通过反转录成cDNA，以转录的cDNA为模板，建立香菇病毒的RT-PCR检测。(I)香菇 dsRNA 的 RT 反应
最佳的RT反应条件为在PCR管中加入100 ng/ul dsRNA IulUO umol/L反向引物Ll-A I. 5 ul、DEPC水7. 5 ul，95°C保温5 min，然后迅速放置冰上5 min。再添加5 X RTBuffer 4 ul、10 mmol/L dNTPs I ul、40 U/ul RNA 酶抑制剂 0. 5 ul、100 U/ul 反转录酶M-MLV 0.5 ul、DEPC水5ul，放置PCR仪上，42°C反应I h，70°C灭活10 min，即得到反转录 的 cDNA。(2) PCR 扩增
PCR最佳扩增体系为:cDNA模板2 ulUOXPCR Buffer 3 ul(含 15 mmol/L MgCl2)'2.5 mmol/L dNTPs I. 5 ul、10 umol/L 引物 Ll-S 5，-ACCGCAATCAATAACT-3，0· 48 ul、10umol/L 引物 Ll-A 5’-AGACAAGATGGAGACG -3’0.48 ul、5 U/ul Taq DNA 聚合酶 0.24 ul,用DEPC水补足至30 ul。PCR 反应条件95°C 5min ；95°C 45second,48. 5°C 45second, 72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin。四、PCR扩增产物检测
具体检测方法为，取PCR扩增产物8 ul加上I. 5 ul 6 X溴酚蓝上样缓冲液，混匀，在I. 0%琼脂糖凝胶,含Goldview DNA染料进行电泳,5V/cm恒压电泳50 min,通过紫外凝胶成像系统观察并照像。或者，取PCR扩增产物8 ul，与1.5 ul 6X溴酚蓝上样缓冲液混匀，点样于1%的琼醋糖凝胶上，于0. 5 X TBE缓冲液中，5V/cm恒压电泳0. 5 lh，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。PCR扩增产物检测结果是含有香菇dsRNA病毒的菌种可特异扩增出852bp的单一片段，如图I所示，若香菇菌种没有带此dsRNA病毒的则扩增不出片段，如图2所示。试验结果证明，用引物Ll-S 5’ -ACCGCAATCAATAACT-3’ 和引物 Ll-A5’ -AGACAAGATGGAGACG -3’对带dsRNA病毒的香菇菌株进行RT-PCR检测时，可检测到一条852bp的条带，而经脱毒的香菇菌株则检测不到这一条带。本发明的利用RT-PCR检测香菇菌株是否带dsRNA病毒的方法，其检测时间短、灵敏度高、检测结果可靠、容易判断。本发明所使用的主要培养基、试剂和仪器如下(所有化学试剂均为分析纯)
1、PDA斜面培养基马铃薯200g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然，121°C灭菌30min;
2、PDA液体培养基马铃薯200g，葡萄糖20 g，水1000 mL，pH自然，121°C灭菌30min;
3、一步 RT-PCR 试剂盒(RevertiAid First Strand cDNA Synthesis Kit)购自Fermentas 公司;
4、0.5XTBE:44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3>I mmol/L EDTA ；
5、上样缓冲液0.1%溴酚蓝，40%蔗糖；6、EB10 mg/ml 溴化乙锭； 7、PCR扩增试剂购自大连宝生物公司。
权利要求
1.一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物，其特征在于所述RT-PCR引物如下正向引物 Ll-S 5’ -ACCGCAATCAATAACT-3’，反向引物 Ll-A 5’ -AGACAAGATGGAGACG-3’。
2.一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于首先提取香菇dsRNA，通过反转录成cDNA，然后以反转录的cDNA为模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测，RT-PCR产物大小为852bp。
3.根据权利要求2所述的香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述RT-PCR检测方法具体包括以下步骤 (1)香菇dsRNA的提取； (2)将提取的香菇dsRNA通过反转录成cDNA:在PCR管中加入10 100 ng/ul dsRNAIulUO umol/L反向引物Ll-A O. 3 O. 5 ul、DEPC水8. 5 8. 8 ul，95 100°C保温5 min,然后迅速放置冰上5 min，再添加5XRT Buffer 4 ul、10 mmol/L dNTPs O. 5 2 ul、40 U/ul RNA 酶抑制剂 0.5 ulUOO U/ul 反转录酶 M-MLV O. 3 O. 5 ul、DEPC 水 3 4. 7ul，放置PCR仪上，42°C反应I h，70°C灭活10 min，即得到反转录的cDNA ;其中反向引物Ll-A为.5， -AGACAAGATGGAGACG-3，； (3)RT-PCR检测以反转录的cDNA为模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测，PCR扩增体系cDNA 模板 I 3 ulUO XPCR Buffer 3 ul，含 15 mmol/L MgCl2,2. 5 mmol/LdNTPs I 2.4 ul、10 umol/L 正向引物 Ll-S O. 5 0. 7 ul、10 umol/L 反向引物 Ll-A.0.5 0. 7 ul、5 U/ul Taq DNA聚合酶0. 3 0. 6 ul，用DEPC水补足至30 ul ;其中正向引物 Ll-S 为 5’ -ACCGCAATCAATAACT-3’，反向引物 Ll-A 为 5’ -AGACAAGATGGAGACG-3’ ；PCR 反应条件95°C 5min ；95°C 45second,48. 5°C 45second, 72°C lmin，30 个循环；.72 °C IOmin ； (4)RT-PCR产物的检测结果根据电泳检测的DNA图谱，若扩增出分子量为852bp的特异DNA条带标记为香菇菌株带有dsRNA病毒，若未扩增出特异DNA条带则表示不携带dsRNA病毒。
全文摘要
本发明涉及一种香菇病毒检测方法，具体涉及一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物及检测方法，属于生物技术领域。所述RT-PCR引物见SEQNO.1-2，检测方法首先提取香菇dsRNA，通过反转录成cDNA，然后以反转录的cDNA为模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测，RT-PCR产物大小为852bp。本发明检测时间较短、灵敏度高(检测体系只需要10ng的dsRNA就可清晰检测出，用病毒特有引物进行反转录，增强了特异性和提高检测结果的可靠性)、检测结果可靠、容易判断、重复性好等优点。基因是遗传的物质基础，不易受外界因素等的影响，同时得到的检测图谱具有特异性条带852bp，其显性标记判断一目了然。
文档编号C12Q1/68GK102888470SQ20121042345
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者吴小平, 刘新锐, 郭杰, 谢宝贵 申请人:福建农林大学