水稻启动子p-G8及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个水稻启动子p-G8及其应用。本发明提供的DNA片段，为如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，本发明发现的启动子，含有ABRE逆境响应元件，在水稻小穗、颖壳和枝梗中特异表达，该启动子为组织特异性启动子；本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
【专利说明】水稻启动子P-G8及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种水稻启动子P-G8及其应用。
【背景技术】[0002]水资源短缺正成为制约我国乃至世界农业发展的重要因素。我国现人均水资源占有量仅为世界人均水平的1/4，缺水已经成为我国工农业生产和人民生活面临的主要问题之一。培育耐旱品种是当前多种农作物育种工作中的重要课题。以水稻为例，水稻是我国最重要的粮食作物之一，总产量占粮食总产量40%左右，但同时又是一种需水量很大的作物，日益严峻的水资源短缺已经成为稻作生产面临的重要问题之一。在有限的水资源条件下实现水稻高产、稳产，必须培育耐旱水稻品种。研究水稻耐旱遗传学基础，加强稻属耐旱基因资源的发掘、创新和利用具有十分重要的现实意义。
[0003]普通野生稻(0.rufipogon Griff.)作为栽培稻(0.sativa L.)的祖先，是栽培稻遗传改良的重要基因库。野生稻在进化成栽培稻的过程中，不仅很多农艺性状发生了很大的变化，而且遗传多样性降低，等位基因数减少，Sun等研究表明栽培稻中的等位基因仅为野生稻的60%。
[0004]被誉为“植物大熊猫”的江西东乡野生稻(0.rufipogon Griff.)是目前世界上生境最北(28° 14' N)的野生稻，与栽培稻隔离条件好，没有栽培稻基因渗入，具有耐低温、耐干旱的特性。从野生稻中发掘、定位、克隆耐旱相关基因，将对水稻生产具有重要意义。
[0005]我国野生稻资源丰富，从野生稻中发掘、定位、克隆耐旱相关基因及其旱诱导启动子，将对水稻生产具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是提供一种DNA片段。
[0007]本发明提供的DNA片段，为如下I)或2)或3)的DNA分子:
[0008]I)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0009]2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
[0010]3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
[0011]上述严格条件可为在0.1 XSSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0012]序列表中序列I的DNA序列由1830个核苷酸组成，含有ABRE作用元件。
[0013]含有上述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
[0014]上述重组载体为将上述DNA片段插入表达载体中，得到重组载体；具体为将序列表中的序列I所示的DNA片段插入pCambial381的EcoRI和HindIII酶切识别位点间得到的重组质粒。
[0015]扩增上述DNA片段的全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。[0016]上述引物对中由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
[0017]上述DNA片段在启动目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围。
[0018]上述应用中，所述目的基因表达为组织特异表达。
[0019]上述应用中，所述组织为植物的小穗、颖壳和枝梗中的至少一种。
[0020]上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
[0021]上述应用中，所述目的基因为⑶S基因。
[0022]本发明的实验证明，本发明发现一种启动子，含有ABRE逆境响应元件，将导入水稻，在水稻中驱动GUS基因的表达，结果表明，在水稻小穗、颖壳和枝梗中特异表达，该启动子为组织特异性启动子；本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为基因在30%PEG处理前(O)和处理2、4、8、16、24、36、48和72小时后的表达
谱
[0024]图2为以IL23基因组DNA为模板，在引物⑶S8引导下的PCR扩增产物
[0025]图3为p-G8转基因水稻的⑶S组织染色及基因G8在不同组织中的相对表达量分析
【具体实施方式】
[0026]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任公司完成。
[0029]耐旱系IL23水稻:(公众可以从中国农业大学获得；参考文献:ZhangX, Zhou SX, Fu Y C，et al.1dentification of a drought tolerant introgressionlinederived from Dongxiang common wild rice(0.rufipogon Griff.).Plant MolBiol,2006, 62:247-259)。
[0030]桂朝2号水稻:(中国作物种质资源信息网，http://icgr.caas.net.cn/ ;库编号:I1A49054)。
[0031]pCambial381 即 NCBI 中的 Binary vector pCAMBIA-1381,为环形质粒,其核苷酸序列见 NCBI 中的如下序列:GenBank:AF234302.1 ;VERSION:AF234302.1 ;G1: 7638091。植物表达载体pCambial381的核苷酸序列中，第9810至10590位核苷酸为CaMV35S启动子(组成型启动子)，用来启动潮霉素基因；第2-1855位核苷酸为⑶S基因；第7214-8008位核苷酸为aadA基因(卡那霉素抗性基因)；第8749-9774位核苷酸为hpt II基因(潮霉素抗性基因)。
[0032]日本晴水稻:(中国作物种质资源信息网，http://icgr.caas.net.cn/ ;库编号:I1A13071)。[0033]实施例1、水稻旱诱导启动子p-G8的获得
[0034]一、旱诱导基因的发现
[0035]首先以耐旱系IL23水稻及对照亲本桂朝2号(GC2)水稻为材料进行芯片(芯片为Affimetrix 公司的水稻全基因组芯片(GeneChip* Rice Genome Array),货号:900599)杂交，并在芯片数据分析的基础上，结合比较基因组学分析，筛选耐旱相关基因，经过基因组比较、耐旱相关性分析，最后获得耐旱基因G8，30%PEG处理条件下，基因的表达量明显增加(图1)，是旱诱导基因。
[0036]二、旱诱导启动子P-G8的获得
[0037]利用primerf引物设计软件设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶EcoRI 和 HindIII 识别位点及保护碱基。GUS8F:5，-GCGAATTC GATATCGACTTCGGAGAGA-3’ ；GUS8R:5，-GCAAGCTT AGCCCAAGAAAGATCGCGCA-3’。⑶S8F中，带下划线碱基为限制性内切酶EcoRI识别位点及保护碱基；GUS8R中，带下划线碱基为限制性内切酶HindIII的识别位点及保护碱基。
[0038]以耐旱系IL23水稻的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为:先940C 5min ;然后 94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C 2min,共 30 个循环；最后 72°C IOmin,获得目的产物。反应结束后，对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，I为Marker IIK所用Marker为天根生化科技有限公司的Marker III，货号:MD103_01)，2为PCR产物。
[0039]将PCR产物进行测序，测序结果表明，PCR产物具有序列表的序列I自5’末端第I至1830位核苷酸所示的DNA片段，将序列表的序列I自5’末端第I至1830位核苷酸所示的DNA片段命名为p-G8 (旱诱导启动子)。
[0040]用分析软件(http://www.dna.affrc.g0.jp/PLACE)对启动子进行分析,发现在其区域内含有与逆境胁迫相关的顺式作用元件ABRE。
[0041]实施例2、p-G8转基因水稻的获得及其鉴定
[0042]一、p-G8植物表达载体的构建
[0043]1、以耐旱系IL23水稻的基因组DNA为模板，用特异性引物对⑶S8(⑶S8F/⑶S8R)进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化1830bp的DNA片段(p-G8)(所用回收试剂盒为天根生化科技有限公司的DNA产物纯化试剂盒，货号:DP204-02)。
[0044]2、用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切步骤I回收的PCR产物。
[0045]3、用限制性内切酶EcoRI和Hindi 11酶切植物表达载体pCambial381，回收载体骨架(约 10650bp)。
[0046]4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒。
[0047]5、将重组质粒进行测序,测序结果表明，得到了重组质粒pCambial381_pG8,该载体为将序列表的序列I自5’末端第I至1830位核苷酸所不的DNA片段插入pCambial381的EcoRI和HindIII酶切位点之间得到(pCambial381载体中的⑶S无自带启动子，其中NCBI中描述的35S是启动潮霉素的启动子)。。
[0048]二、p-G8转基因水稻的获得
[0049]将pCambial381_pG8用基因枪法转化日本晴的成熟胚愈伤组织,用含50mg/L潮霉素的NB培养基进行2轮筛选，每轮筛选20-30天，经预分化、分化得到植株。
[0050]1、将水稻品种“日本晴”的成熟胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒pCambial381-pG8轰击到愈伤组织,具体步骤如下:
[0051](I)将水稻品种“日本晴”的成熟胚愈伤组织在高渗透培养基(NB培养基+91.2g/L甘露醇)上进行渗透处理6h (28°C，暗培养)。
[0052](2)用重组质粒pCambial381-pG8包裹直径110 μ m金粉，采用PDS-1000/He基因枪Bio-Red公司生产)，选择IlOOPsi的可裂膜,载样距祀材料6cm进行轰击。
[0053](3)轰击后的愈伤组织继续在原培养基上培养16h (28°C，暗培养)。
[0054]2、将完成步骤I的愈伤组织转移到恢复培养基(NB培养基+2mg/L 2，4_D)上，恢复培养I周(28°C，暗培养)。
[0055]3、将完成步骤2的愈伤组织转移到筛选培养基(NB培养基+50mg/L潮霉素)上，28°C暗培养30天，筛两轮。
[0056]4、将步骤3得到的愈伤组织转移到预分化培养基上(NB培养基+5mg/L ABA+50mg/L 潮霉素 +2mg/L NAA+lmg/L 6-BA)暗培养 15 天，28°C。
[0057]5、将步骤4得到的抗性愈伤转到分化培养基上(NB培养基+2mg/L6_BA+ Img/LNAA+lmg/L KT+50mg/L潮霉素)28°C光照培养约15天。
[0058]6、将步骤5中幼苗移到生根培养基上(1/2MS+0.5mg/L NAA+0.09g/L肌醇+30g/L蔗糖)28 °C光照培养约30天。
[0059]7、将步骤6中苗高7-8cm且根系发达的植株移栽到花盆，放置于温室中培养3周，成活的植株即为Ttl代植株。
[0060]将植株进行PCR鉴定(引物为潮霉素引物1F5’ -tacttctaca cagccatc-3’和IR，5’-cgtctgtcga gaagtttc-3’得到约1000bp的为阳性植株),结果表明，得到的阳性植株为Ttl代转基因水稻。
[0061]将空载pCambial381用基因枪法转化日本晴的成熟胚愈伤组织，用上述方法得到Ttl代转空载体对照水稻(引物为潮霉素引物1F5’ -tacttctaca cagccatc-3’和IR，5’ -cgtctgtcga gaagtttc-3’ 得到约 1000bp 的为阳性植株)。
[0062]三、转基因水稻的组织表达特异性分析
[0063]1、⑶S组织染色
[0064]对Ttl代转基因水稻、Ttl代转空载体对照水稻的根、叶片、叶鞘、茎、茎节、叶节、枝梗、颖壳和小穗进行⑶S组织染色。
[0065] 结果如图3A所示，3A为p_G8转基因水稻的⑶S组织染色结果；结果发现Ttl代转基因水稻的⑶S基因在小穗、颖壳和枝梗中具有较高的表达活性(蓝色)，而在其他组织中的表达量极低，甚至不表达(没有颜色)，而Ttl代转空载体对照水稻任何组织均不表达GUS (空载中没有启动子启动⑶S表达，而载体中的35S启动子只是启动潮霉素基因的表达)。
[0066]上述实验结果均表明，T0代转基因水稻中的⑶S基因得到表达，证明P-G8为启动子，可以启动GUS的表达，且为组织特异性启动子。
[0067]2、G8基因在IL23和GC2各组织中的相对表达量
[0068]分别提取IL23和桂朝2号水稻的根、叶片、叶鞘、茎、茎节、颖壳、枝梗和小穗的 RNA，反转录得到 cDNA 作为模板，以 G8F:5’ -TCAAAAACATCGGTCGATCA-3’，G8R:5’ -CTCTACAGGCGGGCTTCTTA-3’ ；为引物，进行RT-PCR，以18S为内参，内参的引物为18S-F5'-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3' , 18S-R 5' -GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3'。实验重复三次，结果取平均值。[0069]结果如图3B所示，基因G8仅在渗入系IL23的枝梗、小穗和颖壳中具有较高的表达量，而在其他组织中及桂朝2号的各组织中表达量极低，甚至不表达。[0001]
【权利要求】
1.一种DNA片段，为如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子； 3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为将权利要求1所述DNA片段插入表达载体中，得到重组载体。
4.扩增权利要求1所述DNA片段的全长或其任意片段的引物对。
5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于:所述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所不的单链DNA分子组成。
6.权利要求1所述DNA片段在启动目的基因表达中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于:所述目的基因表达为组织特异表达。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于:所述组织为植物的小穗、颖壳和枝梗中的至少一种。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于: 所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
10.如权利要求6-9中任一所述的应用，其特征在于: 所述目的基因为GUS基因。
【文档编号】C12N15/11GK103834654SQ201210479112
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月22日 优先权日:2012年11月22日
【发明者】孙传清, 刘凤霞, 张侠, 周少霞, 王娜, 谭禄宾, 朱作峰, 付永彩, 才宏伟 申请人:中国农业大学