一种大麦蛋白HvMYB6及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种大麦蛋白HvMYB6及其编码基因与应用。本发明提供的一种蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗病相关或具有转录激活活性的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现了一种蛋白HvMYB6，将其瞬时表达，发现其可以抗大麦白粉菌生理小种K1或A6引起的病害，进一步研究发现该蛋白还具有转录激活活性，其可以作为转录激活因子。上述研究表明，该蛋白可以为培育具有抗病性的转基因植物的研究奠定基础。
【专利说明】—种大麦蛋白HvMYB6及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种大麦蛋白HvMYB6及其编码基因与应用。【背景技术】
[0002]大麦白粉病(Powdery mildew)是大麦主要病害之一，发生在潮湿和半潮湿地区，分布于世界各产麦国。在欧洲是最普遍的破坏性病害，大流行年份可造成减产25%~30%。在日本及北美的东部和南部地区、中国的贵州、四川及东南沿海麦区普遍发生，可造成20%以上的产量损失。在福建则是大麦主要病害。该病可侵害大麦植株地上部各器官，但以叶片和叶鞘为主，发病重时颖壳和芒也可受害。由于大麦白粉病菌具有群体大、适应范围广、生理小种众多，且变异速度快，使得许多有效抗病基因丧失抗性。目前育种工作者一直以选育和推广抗病品种作为病害的主要防治手段，多年来颇见成效，但抗性丧失一直是未能解决的问题，抗源多样化是实现抗病性持久的有效途径。为此通过生物学的方法克隆新的抗病基因，利用转基因的方法提高大麦对白粉病的抗性是今后防治白粉病的有效策略之一。
【发明内容】
[0003]本发明的一个目的是提供一种大麦蛋白HvMYB6及其编码基因。
[0004]本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b):
[0005](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0006](b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗 病相关或具有转录激活活性的由序列2衍生的蛋白质。
[0007]上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列I所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表2所示的标签的编码序列得到。
[0008]上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的变异引起的，有的是由人工诱变处理引起的。
[0009]编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。
[0010]上述基因为如下I) -3)中任意一种的DNA分子:
[0011]I)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0012]2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码与抗病相关或具有转录激活活性蛋白的DNA分子；
[0013]3)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与抗病相关或具有转录激活活性蛋白的DNA分子。
[0014]上述严格条件为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用
2X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。[0015]含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围；其中，重组载体可以为将序列表中的序列I插入pUB1-Adaptor-NOS载体中得到的载体；也可以为将序列表中的序列I插入35S-BD载体的EcoR I与Sal I酶切位点间得到的载体。
[0016]扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围；上述引物对可以是由序列表中的序列3所示的DNA分子和序列表中的序列4所示的DNA分子组成。
[0017]上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗病或使植物抗病中的应用也是本发明保护的范围。
[0018]上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育具有抗病性的转基因植物中的应用也是本发明保护的范围。[0019]在上述应用中，所述抗病为抗白粉病；所述白粉病具体为大麦白粉病(Blumeriagraminis f.sp.tritici);上述大麦白粉病菌具体为大麦白粉菌生理小种Kl或A6 ；
[0020]上述植物为双子叶植物或单子叶植物；其中单子叶植物具体为大麦；本发明的实施例中的大麦品种为Pallas (不含任何Mia)、POl (含Mlal)、P03 (含Mla6)或P09 (含MlalO)。
[0021]上述蛋白在作为转录激活因子中的应用也是本发明保护的范围。
[0022]上述蛋白作为转录激活因子体现在激活基因表达；本发明的实施例中基因为报告基因LUC。
[0023]本发明的实验证明，本发明发现了一种蛋白HvMYB6，将其瞬时表达，发现其可以抗大麦白粉菌生理小种Kl或A6引起的病害，进一步研究发现该蛋白还具有转录激活活性，其可以作为转录激活因子。上述研究表明，该蛋白可以为培育具有抗病性的转基因植物的研
究奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为大麦表皮细胞过表达HvMYB6的表型图
[0025]图2为HvMYB6转录激活报告基因表达结果图
[0026]图3为HvMYB6定位于细胞核内的结果图
[0027]图4为HvMYB6受大麦白粉菌诱导的表达图
【具体实施方式】
[0028]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030]下述实施例中的部分材料如下(请核实提供文献的生物材料的名称在专利和文章中一致):
[0031]大麦Pallas 记载在 Nuclear activity of MLA immune receptorslinksisolate—specific and basal disease-resistance responses.Science315，1098 - 1103，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
[0032]大麦POl 记载在 Nuclear activity of MLA immune receptorslinksisolate—specific and basal disease-resistance responses.Science315，1098 - 1103，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
[0033]大麦P03 记载在 Nuclear activity of MLA immune receptorslinksisolate—specific and basal disease-resistance responses.Science315，1098 - 1103，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
[0034]大麦P09 记载在 Nuclear activity of MLA immune receptorslinksisolate—specific and basal disease-resistance responses.Science315，1098 - 1103，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
[0035]Columbia 型拟南芥(col-Ο)记载在 Molecular characterization ofthesubmergence response of the Arabidopsis thaliana ecotype Columbia.NewPhytologist.2011，190:457 - 471，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得;
[0036]大麦白粉菌生理小种Kl 记载在 Recognition Specificity and RARl/SGTlDependence in Barley Mla Disease Resistance Genes to the Powdery MildewFungus.Plant Cell, 2003, 15:732-744，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得;
[0037]大麦白粉菌生理小种A6 (Blumeria graminis f.sp.Hordei)记载在RecognitionSpecificity and RAR1/SGT1 Dependence in Barley Mla DiseaseResistance Genesto the Powdery Mildew Fungus.Plant Cell，2003，15:732-744，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
[0038]质粒pUbiGUS 记载在 A Transient Assay System for the FunctionalAssessmentof Defense-Related Genes in Wheat.MPMI，1999，12:647 - 654，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
[0039]pUB1-Adaptor-NOS 记载在 Recognition Specificity and RAR1/SGT1Dependencein Barley Mla Disease Resistance Genes to the Powdery Mildew Fungus.Plant Cell，2003，15:732-744，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
[0040]35S-BD 载体记载在 Soybean GmPHD-type transcription regulatorsimprovestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoSONE, 2009，4(9): e7209，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
[0041]35S-BD-VP16 记载在 Soybean GmPHD-type transcription regulatorsimprovestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoSONE, 2009，4(9): e7209，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
[0042]5XGAL4-LUC 记载在 Soybean GmPHD-type transcription regulatorsimprovestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoSONE, 2009，4(9): e7209，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
[0043]Pptrl 记载在 Soybean GmPHD-type transcription regulators improvestresstolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoS ONE，2009，4 (9): e7209，公众可从中国科学院遗传与发育 生物学研究所获得；
[0044]pUB1-Gateway-eYFP 载体记载在 The CC-NB-LRR-type Rdg2a resistancegeneconfers immunity to the seed-borne balrey leaf stripe pathogen in theabsenceof hypersensitive cell death.PLoS One, 2010，5:el2599,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0045]PUB1-CFP-HvffRKY2 载体记载在 Nuclear activity of MLA immune receptorslinksisolate—specific and basal disease-resistance responses.Science315，1098 - 1103，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0046]实施例1、HvMYB6基因的获得
[0047]1、RNA 的获得
[0048]大麦品种POl的7天幼苗接种大麦白粉菌生理小种Kl，24小时后取材,提RNA。
[0049]2、反转录获得cDNA
[0050]I)反转录体系及过程
[0051]RNA2.5ul
[0052]01igo-dT Iul
[0053]DEPC-H2O 6.5ul
[0054]离心管混合上述溶液，700C 5分钟，冰上再放置5分钟。
[0055]
【权利要求】
1.一种蛋白，是如下（a)或（b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗病相关或具有转录激活活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下I)-3)中任意一种的DNA分子： 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码与抗病相关或具有转录激活活性蛋白的DNA分子； 3)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与抗病相关或具有转录激活活性蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述重组载体具体为将权利要求2或3所述基因插入表达载体中，得到表达权利要求I所述蛋白的重组载体。
5.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
6.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗病或使植物抗病中的应用。
7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育具有抗病性的转基因植物中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述抗病为抗白粉病； 所述白粉病具体为大麦白粉病。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于： 所述大麦白粉病的病原菌为大麦白粉病菌（Blumeria grminis f. sp. tritici);所述大麦白粉病菌具体为大麦白粉菌生理小种Kl或A6 ; 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物具体为大麦。
10.权利要求1所述蛋白在作为转录激活因子中的应用。
【文档编号】C12N15/63GK103833836SQ201210477927
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月22日 优先权日:2012年11月22日
【发明者】常诚, 荆邵娟, 沈前华 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所