温敏细胞培养支持物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种细胞培养支持物，其包含：基质和与温敏聚合共混物层，其中所述聚合共混物层包含至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂。本发明还涉及一种生产细胞培养复合物的方法，其包含：提供基质；将至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂混合以提供一种聚合共混物；将所述聚合共混物的薄膜涂覆到基质上以提供基质上的聚合共混物层；固化基质上的所述聚合共混物层以提供细胞培养支持物；以及将细胞沉积到所述细胞培养支持物上，其中所述细胞还可任选地包含培养基，以提供一种细胞培养复合物。
【专利说明】温敏细胞培养支持物
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2011年4月8日提交的美国临时申请序列号61/473，318的优先权。【技术领域】
[0003]本发明涉及细胞培养支持物和生产细胞培养支持物的方法。更具体地，本发明涉及温敏性聚合物细胞培养支持物，其易接受细胞附着和随后的快速细胞片脱离。这些支持物适用于，例如，生物医学应用中，如组织工程学。
[0004]发明背景
[0005]以前制备温敏细胞培养支持物的方法使用了两种主要途径，即电子束辐射或等离子体聚合，以共价接枝聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAm)链到组织培养聚苯乙烯板上。这些方法中所需的复杂程序和装置妨碍具有成本效益地采用这种技术用于具体的应用。此外，以前的方法一般需要使用来自其他个体或其他物种的添加的粘着蛋白以促进细胞附着，并且这种外源添加会在移植后引起细胞片产物的免疫原性反应。不采用温敏性聚合物(TRP)从细胞培养支持物脱离和收集细胞片的其他方法采用了蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)或机械搅拌，其导致了对细胞及其分泌细胞外基质(ECM)的损伤，因此负面影响其生物机能。[0006]Nagase 等人，如在 J.R.Soc.1nterface (2009) 6，S293-S309 中所公开的并且该内容以引用的方式全部并入本文，教导了使用电子束聚合技术的温敏微观结构表面允许，例如，大鼠原代肝细胞和牛动脉内皮细胞的选择性粘着和生长。美国公开第2010/0216242号公开了一种细胞培养支持物，其包括展示温敏性的聚合物层和通过用反应气体等离子处理其表面层部分所获得的细胞培养区，同时限制细胞粘着蛋白(如胶原)的添加。然而，广泛使用这些方法仍然是非常昂贵的。
[0007]Fujita等人，正如在Biotechnology and Bioengineering, Vol.103, N0.2, Junel,2009所公开的并且该内容以引用的方式全部并入本文，教导了制造细胞片-聚合物膜涉及温敏性聚合物，其中细胞附着到与层粘连蛋白和胶原IV混合的温敏聚-N-异丙基丙烯酰胺膜。如上所述，添加的粘着蛋白是不理想的，因为它们可引起有害的免疫原性反应。
[0008]在本领域中，需要没有这些各种缺点的细胞培养支持物和从其中培养和脱离细胞片的方法。此外，该方法应当是简单的并且具有成本效益的以使其在一般生物医学应用中经济可行。
【发明内容】
[0009]本发明提供一种简单和具有成本效益的途径以使用市售材料来产生温敏细胞培养支持物。这可有益地实现而无需使用昂贵的电子束辐射或等离子体聚合技术。另外，有利地，本方法不含添加的粘着蛋白而且还不含机械搅拌或酶促辅助脱离方法。本发明的细胞培养支持物使用一种包含温敏性聚合物和网构粘合促进剂的聚合共混物，其中网构粘合促进剂增强细胞在细胞培养支持物上的附着和生长。已经发现本发明的细胞培养支持物支持细胞附着和增殖以及快速细胞片脱离。
[0010]在一个实施方案中，本发明提供温敏细胞培养支持物，其可以通过旋涂随后热退火处理来容易地产生，得到的支持物允许细胞和和融合细胞片的加速脱离。可再次使用得到的支持物(如果需要)最多三次用于细胞附着/生长和脱离；可以通过定制共混物中的温敏性聚合物和网构粘合促进剂的比例来控制脱离时间。术语退火和固化在本文中可互换使用。
[0011]在一个或多个实施方案中，本发明提供一种细胞培养支持物，其包含:基质和与所述基质结合的聚合共混物层，其中所述聚合共混物层包含至少一个温敏性聚合物和至少一个网构粘合促进剂。[0012]在一个或多个实施方案，本发明提供一种细胞培养复合物，其包含:基质聚合共混物层，其中聚合共混物层包含至少一个温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂；以及培养的细胞层，其中培养的细胞层是可快速脱离的。
[0013]在一个或多个实施方案中，本发明提供一种产生细胞培养支持物的方法，其包含:提供基质；将至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂混合以提供一种聚合共混物；将所述聚合共混物的薄膜涂覆到基质上以提供基质上的聚合共混物层；以及固化基质上的所述聚合共混物层以提供细胞培养支持物。
[0014]在一个或多个实施方案中，本发明提供一种产生细胞培养复合物的方法，其包含:提供基质；将至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂混合以提供一种聚合共混物；将所述聚合共混物的薄膜涂覆到基质上以提供基质上的聚合共混物层；固化基质上的聚合共混物层以提供一种细胞培养支持物；以及将细胞沉积到所述细胞培养支持物上，其中所述细胞还可任选地包含培养基，以提供一种细胞培养复合物。
[0015]在一个或多个实施方案中，本发明提供一种制造细胞片的方法，其包括:提供基质；将至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂混合以提供一种聚合共混物；将所述聚合共混物的薄膜涂覆到基质上以提供基质上的聚合共混物层；固化基质上的聚合共混物层以提供细胞培养支持物；将细胞沉积到所述细胞培养支持物上，其中所述细胞还可任选地包含培养基，以提供一种细胞培养复合物；降低细胞培养复合物的温度到低于LCST以快速地脱离培养的细胞层；以及收集培养的细胞层以提供细胞片。
[0016]在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-13段中的任何一段，其中基质选自由聚合物材料、玻璃、陶瓷、金属、金属氧化物、水合金属氧化物，及其组合组成的组。
[0017]在一个或多个实施方案，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-14段中的任何一段，其中至少一种温敏性聚合物选自由聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)。聚(N, N- 二乙基丙烯酰胺)(PDEAAm)、聚(N-乙烯基己内酰胺)(PVCL)、聚[甲基丙烯酸2_( 二甲基氨基)乙酯)(H)MAEMA)和聚(环氧乙烷)(PEO)及其组合组成的组。
[0018]在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9 - 15段
落中的任何一段，其中至少一种温敏性聚合物是聚(N-异丙基丙烯酰胺)，其由下式表示；
[0019]
【权利要求】
1.细胞培养支持物，其包含: 基质和 聚合共混物层，其结合到所述基质，其中所述聚合共混物层包含至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂。
2.根据权利要求1所述的支持物，其中所述基质选自由聚合物材料、玻璃、陶瓷、金属、金属氧化物、水合金属氧化物，及其组合组成的组。
3.根据权利要求1所述的支持物，其中至少一种温敏性聚合物选自由聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(N，N- 二乙基丙烯酰胺)(TOEAAm)、聚(N-乙烯基己内酰胺)(PVCL)、聚[甲基丙烯酸2-( 二甲基氨基)乙酯)(PDMAEMA)、和聚(环氧乙烷)(PEO)及其组合组成的组。
4.根据权利要求1所述的支持物，其中所述至少一种温敏性聚合物是聚(N-异丙基丙烯酰胺)，其由下式表示:
5.根据权利要求1所述的支持物，其中所述至少一种网构粘合促进剂的特征在于具有官能氨基或羧酸基团。
6.根据权利要求1所述的支持物，其中所述至少一种网构粘合促进剂是氨基硅烷。
7.根据权利要求1所述的支持物，其中所述至少一种网构粘合促进剂选自由3-氨基丙基三乙氧基硅烷(AElES)、3-氨基丙基二乙氧基甲基硅烷(APDEMS)和3-氨基丙基甲氧基硅烷(APTMS)及其组合组成的组。
8.如权利要求1所述的支持物，其中所述至少一种网构粘合促进剂是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES),其由下式表示:
9.根据权利要求1所述的支持物，其中聚合共混物的特征在于具有从约90:10至约40:60的温敏性聚合物与网构粘合促进剂比(TRP =NFAP)。
10.根据权利要求1所述的支持物，其中聚合共混物层不含粘着蛋白。
11.根据权利要求1所述的支持物，其中所述聚合共混物层不含等离子体或电子束处理。
12.—种生产细胞培养支持物的方法，其包含: 提供基质； 将至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂混合以提供一种聚合共混物； 将所述聚合共混物的薄膜涂覆到所述基质上以提供所述基质上的聚合共混物层； 固化所述基质上的所述聚合共混物层以提供细胞培养支持物；以及将细胞沉积到所述细胞培养支持物上，其中所述细胞任选地包含培养基，以提供一种细胞培养复合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养的细胞层包含特征还在于为锚定依赖性细胞的细胞。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养的细胞层包含特征还在于为粘着细胞的细胞。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养的细胞层包含细胞，所述细胞选自由成纤维细胞、成肌细胞、肌管细胞、角膜细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、皮肤细胞、表皮细胞、粘膜上皮细胞、间充质干细胞、ES细胞、iPS细胞、成骨细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞、毛根细胞、牙髓干细胞、β -细胞、肝细胞、及其组合组成的组。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养的细胞层包含细胞和培养基。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述聚合共混物的所述薄膜被旋转涂布在基质上。
18.根据权利要求12所述的方法，其中聚合共混物层不含粘着蛋白。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述聚合共混物层不含等离子体或电子束处理。
20.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养的细胞层的所述脱离不含蛋白水解酶或机械搅拌。
【文档编号】C12N5/00GK103649305SQ201280017292
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年4月6日 优先权日:2011年4月8日
【发明者】B-M·纽比, N·帕特尔, J·卡维基亚, 张歌 申请人:阿克伦大学