专利名称：一种同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
最近几年，药物遗传学/药物基因组学在抗肿瘤药物作用机制等方面的研究获得了突破性进展，发现某些抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤效应与特定的一种(或一组)基因的表达和/或多态性显著相关。通 过相关基因的检测，预测化疗及靶向药物的疗效，选择合适的药物进行个体化化疗，已经成为提高疗效、减少无效治疗的合理选择。个体化治疗是根据患者的遗传学特点，采用特异和最佳的药物方案进行治疗的方法。大量临床数据表明，肿瘤组织中ERCC1/RRM1/TYMS/TUBB3等靶标基因mRNA表达水平可以分别预测患者对钼类/吉西他滨/氟尿嘧啶类/抗微管类等常用化疗药物的反应。根据患者肿瘤组织中mRNA表达水平的检测结果，制订个体化治疗方案，有助于选择适合患者的化疗药物，提高治疗的针对性。通过靶标检测选择化疗药物可以避免无效或有害的化疗、节省宝贵的治疗时间与治疗费用。目前检测基因表达(mRNA水平)的方法主要为荧光定量PCR法。荧光定量PCR通过设计特异性的探针序列，经实时定量PCR对目的基因的表达水平进行定量检测。荧光定量PCR具有较高的灵敏度与准确性，可精确定量，操作简单快捷，是当前基因定量检测的主流方法。但是，荧光定量PCR的如下不足限制了它的市场应用:(1)通量低:一次反应只能检测一个基因，对于复杂的药物代谢和调控系统，需要检测多个位点时，就需要多台PCR仪同时工作，效率低，周期长。(2)多个位点检测成本较高:需要进行多个反应才能得到所需的基因表达信息，从而使总的检测成本较高。(3)难以设置内参基因:只能设置外控基因，无法有效的监测RNA质量及整个反应系统。GenomeLab GeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了 96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记,在同一个EP管中同时分析多个基因的表达,能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述荧光定量PCR法存在的缺陷，具有以下优点:1、高通量:本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测30种腹泻病毒，30个位点)，一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。2、准确性强=GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；3、敏感性高，结果重复性好:GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超闻灵敏度；4、方法简便，使用经济=GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；5、精确定量、灵活性强:可精确定量病原体基因拷贝数，可随时根据需求调整检测的靶基因。6、易于实现自动化:就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报
生口 o目前，国内外还没有关于基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒，包括DEPC水、5XRT缓冲液、反转录引物、反转录酶、X溶液，10XPCR缓冲液，PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，所述的反转录引物包括以下表I中14种抗 肿瘤用药相关基因的RT扩增引物及RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括以下表I中14种抗肿瘤用药相关基因的PCR扩增引物、RNA内参的PCR扩增引物及DNA内参的正反向PCR扩增引物，基因序列如下表I所示:表I
权利要求
1.一种同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒，包括DEPC水、5XRT缓冲液、反转录引物、反转录酶、X溶液，IO X PCR缓冲液，PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，其特征在于所述的反转录引物包括以下表中14种抗肿瘤用药相关基因的RT扩增引物及RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括以下表中14种抗肿瘤用药相关基因的PCR扩增引物、RNA内参的PCR扩增引物及DNA内参的正反向PCR扩增引物，基因序列如下表所示:
2.根据权利要求1所述的一种同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒，其特征在于:所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA ;反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向引物带荧光标记。
3.根据权利要求1所述的一种同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照品为上述14种抗肿瘤用药相关基因、RNA内参及反应内参的引物克隆所得DNA片段。
4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒的检测方法，其特征在于具体包括以下步骤: (1)采集样本并提 取核酸 采集患者肿瘤组织的分离培养物，从分离培养物中提取核酸； (2)以患者核酸为模板进行RT反应 取5-20ng/ul的核酸样品RNA5 u L，DEPC水8 y L，5 X RT缓冲液4 y L，RT引物溶液2 y L，RT酶Iii L混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件:48° Cl分钟；42° C60分钟；95° C5分钟；4° C直至收取RT产物；其中RT引物溶液中各RT引物浓度均为500nM，所述的RT引物包括14种抗肿瘤用药相关基因的RT扩增引物及RNA内参的RT扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID N0.1 N0.18所不； (3)以反转录产物为模板进行PCR反应 取RT产物 8.6 ii L，10 X PCR缓冲液2 y L，25mM的氯化镁4 y L，PCR引物溶液2 y L，DNA聚合酶1.4 ii L，X溶液2 ii L混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件:95° ClO分钟；94° C30秒钟，55° C30秒钟，70° Cl分钟，循环35次；70° Cl分钟；4° C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA ;反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向引物带荧光标记，PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，PCR引物包括14种抗肿瘤用药相关基因的PCR扩增引物、RNA内参的PCR扩增引物及DNA内参的正反向PCR扩增引物，基因序列如序列表中SEQ IDN0.19 N0.38所示； (4)GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品取PCR产物0.1-luL, GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75 u L, DNA标准品0.5u L,矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗.传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得抗肿瘤用药相关基因表达水平。
全文摘要
本发明公开了一种同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、X溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，上述反转录引物包括14种抗肿瘤用药相关基因的RT扩增引物及RNA内参的RT扩增引物，基因序列如SEQ ID NO.1-NO.18所示，PCR引物包括14种抗肿瘤用药相关基因的PCR扩增引物、RNA内参的PCR扩增引物及DNA内参的正反向PCR扩增引物，基因序列如SEQ ID NO.19-NO.38所示，优点是特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。
文档编号C12Q1/68GK103074435SQ20131003324
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者南丽, 颜进, 徐冰, 王晴晴, 吴勇 申请人:海尔施生物医药股份有限公司