专利名称：一种能降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母的制作方法
技术领域：
本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，更具体地，涉及一种能降解无定形纤 维素的基因重组酿酒酵母。
背景技术：
目前车用燃料乙醇几乎都是用粮食玉米等为原料生产，大量生产燃料乙醇势必会带来与人争粮的问题，会加剧世界粮食短缺的危机。解决方式是尽量由纤维素(Cellulose)生产乙醇而避免用淀粉和糖类来生产乙醇。纤维素是自然界中存在最广泛的碳水化合物，也是地球上数量最多的可再生资源。在我国，每年植物秸杆等纤维素类物质总量达7亿吨，但目前大部分采用焚烧处理，造成了严重的环境污染和资源浪费。用来源广泛、价格低廉的农林废弃物替代粮食为原料来生产燃料乙醇是一个重点的发展方向，已经被认为是发展循环经济的有效途径。纤维素分子是由D-葡萄糖以β_1，4-糖苷键相联结而成的高分子化合物。利用纤维素生产乙醇的前提是把纤维素有效地水解为葡萄糖。因此，一直以来人们都在寻求降解纤维素的有效方法。目前形成了包括物理方法、酸水解法和酶水解法在内的几种主要处理手段。物理方法既无法完全破坏纤维素的结构，又能耗巨大。酸水解法会造成环境污染，且分解后的产物回收率不高。酶水解法即用纤维素酶进行酶处理的过程，具有反应条件温和，副产物少的特点，被认为是比较有效且更接近自然的一种方法，分解后的产物较易被回收利用，而且污染低。因此，利用低耗能、低污染的生物技术，尤其是微生物发酵法对纤维素进行生物转化是近年来的研究热点。无定形纤维素是聚合度低、结构疏松的纤维素，较容易被试剂渗透，水解较快。无定形纤维素来源广泛,可从农业纤维素废弃物制得。它能被内切β-1，4-葡聚糖酶(Endoβ -1, 4-glucanase,EG)随机切断β _1，4_糖苷键,生成大量带非还原性末端的小分子纤维素片段；这些小分子纤维素片 段又能被β -葡萄糖苷酶(β -D-GluC0SidaSe，BGL)进一步降解,最终水解成为葡萄糖分子。因此将内切β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶两种酶结合，就能直接降解无定形纤维素，生成葡萄糖。酿酒酵母(cererisiae)是工业上乙醇发酵的首选菌种,具有利用葡萄糖合成乙醇的能力，但缺乏有效降解纤维素生成葡萄糖的酶，因此在自然条件下不能直接利用纤维素类物质发酵产生乙醇。若能将上述两种酶的基因导入酿酒酵母，以基因工程手段弥补酿酒酵母纤维素降解能力的缺陷，就可实现利用无定形纤维素发酵生产燃料乙醇的目的，对于解决粮食危机、能源危机均具有重要的指导意义。专利(CN 101319196)中公开了一种能同时分泌表达EG、CBH及BGL的重组酵母，虽然也能够利用无定形纤维素为原料进行乙醇发酵，但是需要在酿酒酵母菌中种同时转入EG、CBH及BGL三种酶基因，构建工艺相对复杂，三种酶基因之间的表达调控也相对复杂
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能 降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母。本发明所要解决的另一技术问题是，提供一种能降解无定形纤维素的基因重 组酿酒酵母的构建方法。本发明的上述技术问题通过以下技术方案予以实现:
一种能降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母，该基因重组酿酒酵母是将内切β -1, 4-葡聚糖酶(EG)基因和β -葡萄糖苷酶(BGL)基因通过酿酒酵母表达载体同时转入酿酒酵母并获得正确的分泌表达而构建成的。作为一种优选方案，所述的酿酒酵母表达载体为酿酒酵母多基因共表达载体。作为一种优选方案，所述酿酒酵母多基因共表达载体为载体pScIKP(专利ZL 2008I 0029630.6)。一种能降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤:
51.将内切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)和β-葡萄糖苷酶基因(BGL)接入酿酒酵母表达载体中，构建重组双基因共表达载体；
52.将上述构建得到的重组双基因共表达载体用限制性内切酶切割，使之线性化后转化到酿酒酵母中，构建转基因酿酒酵母。作为一种优选方案，SI构建重组双基因共表达载体包括如下步骤: 511.分别将内切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)和β-葡萄糖苷酶基因(BGL)进行PCR扩增；
512.用限制性内切酶分别切割载体、内切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)和β-葡萄糖苷酶基因(BGL)；
513.将内切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)和β-葡萄糖苷酶基因(BGL)接入酿酒酵母表达载体中。作为一种优选方案，S2中所述的限制性内切酶为如a I。作为一种优选方案，S2中所述的转化是使用电转化法、冷冻法或化学试剂法进行转化。作为一种优选方案，S12中用于切割内切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)的限制性内切酶为及I和分e I，用于切割葡萄糖苷酶基因(BGL)的限制性内切酶为分e I ；S13中使用的限制性内切酶为I和油a I。作为一种优选方案，上述的内切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)为绿色木霉的内切β -1, 4-葡聚糖酶基因eg3 ;所述的β -葡萄糖苷酶基因(BGL)为绿色木霉的β -葡萄糖苷酶基因知"/7。作为一种最优选方案，上述的内切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)为绿色木霉AS3.3711 (购自广东微生物所菌种保藏中心)的内切0-1，4-葡聚糖酶基因￡^^;所述的β -葡萄糖苷酶基因(BGL)为绿色木霉AS3.3711的β -葡萄糖苷酶基因bgll。绿色木霉AS3.3711的内切β-1，4-葡聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，β -葡萄糖苷酶基因bgll的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本发明所述的能降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母能够降解无定形纤维素并发酵生产乙醇。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
本发明构建的基因重组酿酒酵母由于同时导入了两种外源纤维素酶基因，所以能够降解无定形纤维素成为葡萄糖，而酿酒酵母本身能利用葡萄糖合成乙醇，因此本发明的基因重组酿酒酵母可直接利用无定形纤维素发酵生成乙醇，无需外加另外的具有纤维素降解能力的微生物或纤维素酶共同发酵，也无需事先对无定形纤维素原料进行糖化处理。因此，该基因重组酿酒酵母在利用无定形纤维素做原料生产乙醇的过程中具有操作简便、节能降耗、绿色环保的特点，在新一代石油替代产品一纤维素燃料乙醇的研制方面具有积极的推动作用；
另一方面，本发明所述的酿酒酵母仅需要导入内切β-1，4-葡聚糖酶(EG)基因和β -葡萄糖苷酶(BGL)两种外源纤维素酶基因即可直接利用无定形纤维素发酵生成乙醇，且与专利(CN 101319196)中所述的酿酒酵母具有同样的生产乙醇的能力。其优势在于:①本发明所述的双基因重组酵母的构建方法相对专利(CN 101319196)中三基因重组酵母的构建方法简单，精简了生产步骤，节约了生产成本；②本发明所述的双基因重组酵母在发酵过程中最大乙醇生成量出现的时间比三基因重组酵母短，因此发酵时间短、周期快，节约了时间，降低了能耗，也变相增加了产量本发明所述的双基因重组酵母在降解无定形纤维素时不容易出现反馈抑制现象，因为CBH降解纤维素的产物为纤维二糖，会对EG的酶活产生一定的反馈抑制作用，而本发明构建的双基因重组酵母由于不产生CBH，因此不会产生过多的纤维二糖，也就不会对EG产生反馈抑制作用。
图1为共表达两种纤维素酶基因的重组质粒构建流程图。图2为双基因重组酵母对无定形纤维素降解作用的刚果红染色检验结果图。图3为双基因重组酵母降解无定形纤维素生成乙醇的气相色谱检测示例图。图4为双基因重组酵母降解无定形纤维素并发酵生成乙醇的时间曲线图。图5为三基因重组酵母降解无定形纤维素，发酵生成乙醇的时间曲线图。
具体实施例方式以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对发明不做任何形式的限定。实施例1内切β -1, 4-葡聚糖酶基因eg3、β -葡萄糖苷酶基因bgll的克隆 参照GenBank上发表的里氏木霉(Jrichoderma reesei)纤维素酶基因序列，使用DNA
STAR引物设计软件进行引物设计，同时添加上合适的酶切位点:
基因引物的参考序列为7: reesei EGIII，注册号为M19373。
权利要求
1.一种能降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母，其特征在于该基因重组酿酒酵母是将内切β-1，4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因通过酿酒酵母表达载体同时转入酿酒酵母并获得正确的分泌表达而构建成的。
2.根据权利要求1所述的基因重组酿酒酵母，其特征在于所述的酿酒酵母表达载体为酿酒酵母多基因共表达载体。
3.根据权利要求2所述的基因重组酿酒酵母，其特征在于所述酿酒酵母多基因共表达载体为载体pScIKP。
4.权利要求1至3任一项所述的基因重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤:内切β-1，4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因接入酿酒酵母表达载体中，构建重组双基因共表达载体；上述构建得到的重组双基因共表达载体用限制性内切酶切割，使之线性化后转化到酿酒酵母中，构建转基因酿酒酵母。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，SI构建重组双基因共表达载体包括如下步骤:别将内切β-1，4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因进行PCR扩增；限制性内切酶分别切割载体、内切β-1，4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因； 内切β-1，4-葡聚 糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因接入酿酒酵母表达载体中。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，S2中所述的限制性内切酶为如aI。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，S2中所述的转化是使用电转化法、冷冻法或化学试剂法进行转化。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，S12中用于切割内切β-1，4-葡聚糖酶基因的限制性内切酶为I和分e I，用于切割葡萄糖苷酶基因的限制性内切酶%Spe I ;S13中使用的限制性内切酶为I和油a I。
9.根据权利要求1、4、5或8所述的构建方法，其特征在于，所述的内切β-1，4-葡聚糖酶基因为绿色木霉的内切爲-^^葡聚糖酶基因^於厂所述的β-葡萄糖苷酶基因为绿色木霉的葡萄糖苷酶基因知77。
全文摘要
本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，公开了一种能降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母。该基因重组酿酒酵母是将内切β-1,4-葡聚糖酶(EG)基因和β-葡萄糖苷酶(BGL)基因通过酿酒酵母表达载体同时转入酿酒酵母并获得正确的分泌表达而构建成的。该基因重组酿酒酵母可利用无定形纤维素做原料生产乙醇且具有操作简便、节能降耗、绿色环保的特点，在新一代石油替代产品——纤维素燃料乙醇的研制方面具有积极的推动作用。
文档编号C12N1/19GK103103139SQ201310033518
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者刘泽寰, 龚映雪, 唐根云, 黎惠忠, 肖文娟, 李晶博, 林蒋海 申请人:广州分子生物技术有限公司, 暨南大学