专利名称：一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传学技术领域，涉及一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点，和检测所述基因位点的方法，以及所述基因位点的的用途。
背景技术：
孕妇及母乳的营养是保证胎婴儿健康的关键。母乳中的脂肪酸不仅是婴儿重要的能量来源，而且长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)与婴儿的视功能和脑发育密切相关。n-3系列LCPUFA主要为二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，n_6系列LCPUFA主要为亚油酸和花生四烯酸(AA)。AA、EPA及DHA是最重要的三种LCPUFA，是人类早期发育的必需脂肪酸。在孕末期和新生儿出生的头几个月，脑细胞数量迅速增加，体积增大，为满足这一时期生长的需要，必须供给充足的营养物质。由于婴儿组织和器官的生长发育旺盛，大部分生理功能快速完善，对多不饱和脂肪酸的需求量也较大，而胚胎期的储备通常较少，新生儿，尤其是早产儿，体内的脂肪酸去饱和酶活性较低，由α_亚麻酸合成EPA和DHA的能力低。大部分EPA和DHA都是通过乳汁或奶粉摄入。孕妇及乳母PUFA的膳食推荐摄入量一直是国际研究的热点，但以往的研究大多集中在孕妇及乳母膳食的变化对其血浆及乳汁中PUFA水平的影响，没有考虑到个体的遗传因素差异。FADSl位于人类11号染色体(Ilql2-llql3.1)，由12个外显子和11个内含子构成，Λ 5脂肪酸去饱和酶由FADSl编码，是多不饱和脂肪酸代谢通路上重要的限速酶。去饱和酶的活性直接影响PUFA合成。第一篇报道FADS基因多态性影响血清磷脂脂肪酸水平是在2006年(Schaeffer L, Gohlke H etal.Hum Mol Genet 2006; 15:1745-1756) Innis Sheila 研究小组于 2008 年发现 FADS多态性影响孕妇血浆和红细胞膜磷脂以及乳母乳汁中的n-6和n-3多不饱和脂肪酸水平，(Lin Xie, Sheila M.1nnis.J Nutr.2008，138 (11): 2222-8)。而母亲乳汁中的脂肪酸水平通过母婴传递途径直接影响婴儿的脂肪酸营养状况。此后的多项研究分别探讨了不同国家不同人群的FADS基因多态性对血液、乳汁及组织中脂肪酸水平的影响。目前的研究主要集中在白种人群，中国·孕妇及乳母PUFA水平是否也受FADS基因多态性的影响尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是公开一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点。本发明同时公开了检测所述基因位点的方法。本发明还公开了所述基因位点的用途。本发明通过NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/mapviewer)数据库，获得FADSl 基因位点序列 ο 通过 http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP 及 http://snp.cshl.0rg/数据库，在FADSl基因上选择含有限制性酶切位点的单核苷酸多态性位点rsl74556。下列所示为这个单核苷酸多态性的核苷酸序列。加黑部分为引物序列，方框内是发生互换的碱基，划线处则是MboI限制性内切酶识别的酶切位点，箭头所示内切酶的切割部位。具体信息如下。
权利要求
1.一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点，其特征在于:核苷酸序列为 (1) FADSl locus, SNPs rs!74556 Gene bank accession number: AC004770,1, SNPpositions 6886430, Base change: C/T 6886371 AAGCAGGGAC CTCAAGACTC CCCAGAGCTA CTACTGACTG 6886411 TGATTACTAT GACTGTlGAlg CCATCTAGAC TCTCCTTCCA 6886451 CCCCCTCTCT GTCCCCCTCA ACAACCAATA GTTGCGACAT 6886591 AGCAAACACA GGGTCTTACA TTCTTGGTGC GCT 加黑部分为引物序列，方框内是发生互换的碱基，划线处则是MboI限制性内切酶识别的酶切位点，箭头所示内切酶的切割部位。
2.根据权利要求1所述的一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点的检测方法，其特征在于: 乳母均由外周静脉抽取抗凝血5ml,用WizarcfGenomic DNA Purification Kit试剂盒提取全血基因组DNA ;步骤如下:1.5ml Eppendorf离心管中加入细胞裂解液900 μ 1，加入融化的全血300 μ I吹打混匀，室温反应20min，以13000 rpm离心3min，吸弃上清，加入300 μ I核裂解液，充分振荡反复吹打至团块溶解，37°C水浴30min，加1.5μ I RNase充分混匀，37°C水浴15min，加入100 μ I蛋白沉淀液，充分混匀，室温反应20min，以13000 rpm离心3min，将上清移至加入300 μ I异丙醇的离心管中，反复颠倒混匀，室温反应15min，以13000 rpm离 心3min,轻轻弃上清，留白色沉淀，用吸水纸吸干，加70%乙醇200 μ I洗漆I次，离心轻轻弃上清，用吸水纸吸干，室温干燥20min,加100 μ I DNA溶解液,65°C水浴2h,制成DNA样品，于-20°C冰箱保存，使用美国BECKMAN公司的Du 640紫外分光光度仪，分别取波长260nm、280nm两个波段，测得其相应DNA的0D260nm及0D280nm值，然后再通过公式，计算出DNA含量，公式为:DNA含量=50mg/ml X0D260nmX稀释倍数，另外通过公式计算出DNA纯度，公式为:DNA纯度=0D260nm/0D280nm，依据相应的碱基序列合成引物，正向引物为:5’ AAGCAGGGACCTCAAGAC 3’，反向引物为:5’ AGCCCACCAAGAATGTAA 3’，PCR 反应体系为 20μ 1，其中含上下游引物各(λ 4μΜ，8μ I 2 X Taq MasterMix，DNA 模板 30 50ng,PCR 扩增条件为:① 94°C 5min ② 96°C 30s, 62°C 60s, 72°C 35s 2 个循环；③ 95°C 30s,60°C 60s, 72°C 35s 6 个循环；④ 94°C 55s, 58°C 60s, 72°C 35s 28 个循环；⑤ 72°C lOmin，取PCR产物5 μ I用1.5%琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为分子量标准品，所扩增的片段长度为153bp (6886371 6886683 )，在PCR扩增后的反应体系中，加入适量的限制性内切酶MboI及其酶切缓冲液，置37°C温箱5小时，经2.5%琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判断基因型，存在3种基因型，其中有完全切开的纯合基因型，未切开的纯合基因型，既有切开又有未切开的杂合基因型。
3.根据权利要求1所述的一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点在指导孕妇及乳母营养摄取量的应用。
全文摘要
一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点及应用，属于遗传学技术领域，本发明提供一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点---脂肪酸去饱和酶基因(fattyaciddesaturase1,FADS1)位点。即含有rs174556单核苷酸多态性的FADS1位点。由于该位点的单核苷酸多态性rs174556碱基Ｃ突变为T，从而与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联。FADS1基因rs174556T/T次等位基因纯合子携带者乳母乳汁花生四烯酸及二十碳五烯酸水平显著降低，该位点存在决定乳汁多不饱和脂肪酸水平的单核甘酸多态性。FADS1位点及其编码蛋白对阐明多不饱和脂肪酸代谢机制及建立个体化营养干预，建立针对不同遗传背景而确定适宜的多不饱和脂肪酸膳食推荐摄入量具有重要作用。
文档编号C12N15/11GK103233002SQ20131014142
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者谢林, 刘国良, 甘振威, 杨镜玉, 邓娟, 何纯川, 姜珊 申请人:吉林大学