辅助鉴定欧洲类禽h1n1亚型猪流感病毒的引物组及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的引物组及其应用。本发明提供的引物组，包括引物对乙；所述引物对乙由序列表的序列3所示单链DNA分子和序列表的序列4所示单链DNA分子组成。所述引物组还可包括引物对甲；所述引物对甲由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成。本发明对及时诊断、扑灭疫情以及开展大规模欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的流行病学监测有着积极的意义。
【专利说明】辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的引物组及其应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的引物组及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪流感一种急性、传染性呼吸道疾病，影响猪的发育，延缓猪的生长及出栏时间， 给养殖业带来重大经济损失。猪流感病毒主要包括H1与H3两种亚型。其中欧洲类禽H1N1 亚型猪流感病毒是H1亚型猪流感病毒的一大优势谱系。2006年以后，欧洲类禽H1N1亚型 猪流感病毒成为猪流感病毒的优势流行毒株。
[0003] 传统的流感病毒检测方法为采用鸡胚进行病毒的分离培养(需时2-3天)，然后采 用血凝抑制试验进行流感病毒亚型及分支的鉴定(需时1天)。这种传统的检测方法费时、 费力，不能做出快速而及时的诊断。由于流感病毒抗原特性的变异，常常导致常规血清学方 法无法检出流行毒株，出现漏检的情况。此外，用于猪流感检测的鼻腔拭子样品通常病毒含 量较低，由于普通RT-PCR方法的灵敏度限制，易出现假阴性结果。临床上，迫切需要一种能 快速有效的检测欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的方法，有助于实现对该疾病的实时监测， 对于疫情的防控意义重大。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的引物组及其 应用。
[0005] 本发明提供的引物组，包括引物对乙；所述引物对乙由序列表的序列3所示单链 DNA分子和序列表的序列4所示单链DNA分子组成。所述引物组还可可包括引物对甲；所述 引物对甲由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成。 所述引物组可由所述引物对乙和所述引物对甲组成。
[0006] 本发明还保护所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下（a) 或(b): (a)辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒；（b)辅助鉴定待测样本中是否含有欧 洲类禽H1N1亚型猪流感病毒。所述待测样本可为猪的肝、脑、肺等组织，也可为猪的口腔拭 子、泄殖腔拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为猪的内脏组织(肝、脑、 肺等）或猪的内脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。
[0007] 本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物组；所述试剂盒的用途为如下（a)或（b): (a)辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒；（b)辅助鉴定待测样本中是否含有欧洲类禽 H1N1亚型猪流感病毒。所述待测样本可为猪的肝、脑、肺等组织，也可为猪的口腔拭子、泄殖 腔拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为猪的内脏组织(肝、脑、肺等）或 猪的内脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。
[0008] 本发明还保护所述引物组在辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒中的应用。 所述应用中不包括疾病治疗和诊断方法。
[0009] 本发明还保护第一种辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的方法，包括如下 步骤：以待测病毒的cDNA为模板，用所述引物对乙进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物、 待测病毒为候选的欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒，如果没有得到所述PCR扩增产物、待测 病毒为候选的非欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒。所述PCR扩增产物的大小可为400-500bp， 具体可为462bp。所述待测病毒可为欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒、H9N2亚型猪流感病毒、 H3N2亚型猪流感病毒、H1N2亚型猪流感病毒和经典H1N1亚型猪流感病毒。所述方法为非 疾病治疗和诊断方法。
[0010] 本发明还保护第二种辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的方法，依次包括 如下步骤：（1)以待测病毒的cDNA为模板，用所述引物对甲进行PCR扩增；（2)将完成步骤 (1)的体系作为模板，用所述引物对乙进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物、待测病毒为 候选的欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒，如果没有得到所述PCR扩增产物、待测病毒为候选 的非欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒。所述PCR扩增产物的大小可为400-500bp，具体可为 4 62bp。所述待测病毒可为欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒、H9N2亚型猪流感病毒、H3N2亚 型猪流感病毒、H1N2亚型猪流感病毒和经典H1N1亚型猪流感病毒。所述方法为非疾病治 疗和诊断方法。
[0011] 本发明还保护所述引物组在辅助鉴定待测样本中是否含有欧洲类禽H1N1亚型猪 流感病毒中的应用。所述待测样本可为死亡的猪的肝、脑、肺等组织，也可为死亡的猪的口 腔拭子、泄殖腔拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为猪的内脏组织(肝、 脑、肺等）或猪的内脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。所述应用中不包括 疾病治疗和诊断方法。
[0012] 本发明还保护第一种辅助鉴定待测样本中是否含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病 毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，用所述引物对乙进行PCR扩增，如果 得到PCR扩增产物、待测样本疑似含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒，如果没有得到所述 PCR扩增产物、待测样本疑似不含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒。所述PCR扩增产物的 大小可为400-500bp，具体可为462bp。所述待测样本可为死亡的猪的肝、脑、肺等组织，也 可为死亡的猪的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为 猪的内脏组织(肝、脑、肺等)或猪的内脏组织(肝、脑、肺等)加工得到的生鲜食品或熟食。所 述方法为非疾病治疗和诊断方法。
[0013] 本发明还保护第二种辅助鉴定待测样本中是否含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病 毒的方法，依次包括如下步骤：（1)以待测病毒的cDNA为模板，用所述引物对甲进行PCR扩 增；（2)将完成步骤（1)的体系作为模板，用所述引物对乙进行PCR扩增，如果得到PCR扩 增产物、待测样本疑似含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒，如果没有得到所述PCR扩增产 物、待测样本疑似不含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒。所述PCR扩增产物的大小可为 400_ 500bp，具体可为462bp。所述待测样本可为死亡的猪的肝、脑、肺等组织，也可为死亡 的猪的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为猪的内脏 组织(肝、脑、肺等）或猪的内脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。所述方法 为非疾病治疗和诊断方法。
[0014] 本发明提供的引物组为巢式引物，应用时进行2次PCR扩增，可有效提高灵敏度； 第二次PCR扩增引物结合在第一次PCR扩增产物内部，如果第一次扩增产生了错误片段， 则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，因此，特异性也较强；可以检出 目前我国流行的欧洲类禽H1N1亚型猪流感毒株，具有很好的覆盖性和通用性；所需时间短 (4-5小时)、操作简单、容易推广，便于基层操作和应用。
[0015] 应用本发明提供的引物组辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒，不仅适用于 病毒，也可以适用于临床采集的样品(如鼻腔拭子、脏器样品等)，将成为欧洲类禽H1N1亚型 猪流感病毒疫病诊断和流行病学调查的有用检测工具，有助于及时对猪染病情况及区域、 环境的病毒污染情况作出及时快捷的检测和确诊，以在最短时间内作出正确的处置办法。 本发明对及时诊断、扑灭疫情以及开展大规模欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的流行病学 监测有着积极的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为引物对甲和引物对乙的组合物的特异性结果。
[0017] 图2为引物对乙的组合物的特异性结果。
[0018] 图3为引物对甲和引物对乙的组合物的灵敏度结果。
[0019] 图4为引物对乙的组合物的灵敏度结果。
[0020] 图5为引物对甲和引物对乙的组合物的普适性结果。
【具体实施方式】
[0021] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。以下实施例中，用于提取总RNA的试剂盒为Viral genome RNA rapid extraction Kit (名称：QIAamp Viral RNA Mini Kit)，厂家QIAGEN，货号52904。以下实施例中，用于 将总 RNA 反转录为 cDNA 的试剂盒为 The reverse transcription(RT)reaction (名称： RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)，厂家 Fermentas，货号 K1622。
[0022] 欧洲类禽 H1N1 亚型猪流感病毒（European Avian Influenza Virus-Like HINISwine Influenza A Viruses) ：Jinhua Liu, Yuhai Bi,Kun Qin, Guanghua Fu, Jun Yang, Jinshan Peng, Guangpeng Ma, Qinfang Liu, Juan Pu,and Fulin Tian, Emergence of European Avian Influenza Virus-Like HINISwine Influenza A Viruses in China, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2009, p_ 2643 - 2646。
[0023] 经典 H1N1 亚型猪流感病毒（classical swine HINlinfluenza A virus): Jinxiang ffang&Xian Qi&Chengping Lu,Mutations in the C-terminal tail of NSlprotein facilitate the replication of classical swine HINlinfluenza A virus in mice, Folia Microbiol(2012)57:169 - 175
[0024] H9N2亚型猪流感病毒：杨焕良，乔传玲，陈艳，辛晓光，陈化兰，H9N2 亚型猪流感病毒A/Swine/Shandong/1/02分离株的基因序列分析中国兽医科学 2007, 37(06):473-476。
[0025] H3N2亚型猪流感病毒：齐海涛，孔维立，张桂红，猪流感病毒Η 1、Η 3、N 1、N 2亚 型分型R T _ P C R方法的建立，中国畜牧兽医2012年第39卷第3期。
[0026] H1N2亚型猪流感病毒：杨焕良，乔传玲，陈艳，辛晓光，李一经，陈化兰，猪流 感病毒H1N1、H1N2和H；3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立，中国预防兽医学报，第29卷 第9期，2007年9月。
[0027] 实施例1、特异引物对的设计
[0028] 设计两对用于鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的引物对，分别命名为引物对 甲（外引物对）和引物对乙（内引物对)。
[0029] 引物对甲如下：
[0030] EA-HA-269F (序列表的序列 1) :5, -TGGCAACCCAAMTGTGACT-3,；
[0031] EA-HA-995R (序列表的序列 2) :5, -GGGGCATTCTCCAATAGTG-3,。
[0032] 引物对乙如下：
[0033] EA-HA-429F (序列表的序列 3) :5, -ATTTTCCCAAAGGCAACC-3,；
[0034] EA-HA-S90R (序列表的序列：4) :5, -ATCCGACATCATAATTCCAGAAC-3，。
[0035] 实施例2、引物对乙和引物组的特异性检测
[0036] 实验样本分别为：欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒、H9N2亚型猪流感病毒、H3N2亚 型猪流感病毒、H1N2亚型猪流感病毒和经典H1N1亚型猪流感病毒。
[0037] 一、提取各个待测样本（即病毒浓度为106PFU/100 μ L的病毒液）的总RNA并反转 录为cDNA。
[0038] 二、引物组的特异性
[0039] 1、以步骤一得到的cDNA为模板，用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0040] PCR 扩增的反应体系（25μ 1) :2XMix Bufferl2. 5μ 1、EA-HA-269F0. 5μ 1、 ΕΑ-HA-995R0. 5 μ 1、cDNA2 μ 1，加双蒸水至 25 μ 1。 、
[0041] PCR 扩增的反应程序：94°C 5min;94t； 45s、5：rc 45s、72°C lmin，2〇 个循环； 72〇C lOmin ；4°C 10ho '
[0042] 2、将步骤1得到的PCR扩增产物作为模板，用引物对乙进行pCR扩增，得到 PCR扩 增产物。
[0043] PCR 扩增的反应体系（25μ 1) :2XMix Bufferl2. 5μ 1、EA-HA-429F0. 5μ 1、 EA-HA-890R0. 5 μ 1、步骤1得到的PCR扩增产物2 μ 1，加双蒸水至25 μ 1。
[0044] PCR 扩增的反应程序：94 υ 5min ;94 45s、56 °C 45s、72 °C lmin，20 个循环； 72〇C lOmin ；4°C 10ho '
[0045] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图丨。图i中，丄为 将双蒸水作为模板的阴性对照，2为欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒，3为H_2亚型猪流感 病毒，4为H3N2亚型猪流感病毒，5为H1N2亚型猪流感病毒，6为经典H1N1亚型猪流感^ 毒，Μ为 TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、 lOObp)。结果表明，欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒样本在400-500bp之间显示特异条带， 其他病毒则无相应条带。回收所述特异条带并进行测序，为462bp。
[0046] 三、引物对乙的特异性
[0047]以步骤一得到的CDNA为模板，用引物对乙进行pCR扩增，得到PCR扩增产物，将 PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳. ' '
[0048] PCR 扩增的反应体系（25 μ 1) :2XMix Bufferl2. 5 μ 1、EA-HA-429F0. 5 μ 1、 EA-HA-890R0. 5 μ 1、cDNA2 μ 1，加双蒸水至 25 μ 1。
[0049] PCR扩增的反应程序同步骤二的2。
[0050] 电泳图见图2。图2中，1为将双蒸水作为模板的阴性对照，2为欧洲类禽H1N1亚 型猪流感病毒，3为H9N2亚型猪流感病毒，4为H3N2亚型猪流感病毒，5为H1N2亚型猪流感 病毒，6为经典H1N1亚型猪流感病毒，，Μ为TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。结果表明，欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒样本 在400-500bp之间显示特异条带，其他病毒则无相应条带。回收所述特异条带并进行测序， 为 462bp。
[0051] 实施例3、引物组的灵敏度检测
[0052] -、分别提取病毒浓度为 104PFU/100y L、103PFU/100y L、102PFU/100y L、 10PFU/100 μ L或1PFU/100 μ L的欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的病毒液(按照病毒浓度由 高至低依次命名为病毒液A、病毒液B、病毒液C、病毒液D或病毒液E)的总RNA并反转录为 cDNA。
[0053] 二、引物组的灵敏度
[0054] 1、以步骤一得到的cDNA为模板，用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0055] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的1。
[0056] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的1。
[0057] 2、将步骤1得到的PCR扩增产物作为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩 增产物。
[0058] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的2。
[0059] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的2。
[0060] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图3。图3中，1至5 依次代表病母液A、病母液B、病毒液C、病毒液D和病毒液E，M为TransDNA Marker I (自上 至下依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。结果表明，lOPFU/ΙΟΟμ L 及以上的欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的病毒液进行以上步骤后均可在电泳图中观察到 400-500bp之间的特异条带。回收所述特异条带并进行测序，为 462bp。
[0061] 三、引物对乙的灵敏度
[0062]以步骤一得到的cDNA为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将 PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳.
[0063] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤三。
[0064] PCR扩增的反应程序同步骤二的2。
[0065]电泳图见图4。图4中，1至5依次代表病毒液A、病毒液B、病毒液C、病毒液D和 病毒液 E，M 为 TransDNA Marker I (自上至下依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp、100bp)。结果表明，102PFU/100uL及以上的欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的病毒 液进行以上步骤后均可在电泳图中观察到400-500bp之间的特异条带。回收所述特异条带 并进行测序，为462bp。
[0066]对比步骤二和步骤三，说明引物组(巢式PCR)的灵敏度比引物对乙(普通PCR)高 10倍。
[0067] 实施例4、引物组的普适性
[0068] -、毒株的获得
[0069] 欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒毒株1 :2008年，从中国山东省具有发病表型的病 猪体内分离得到。欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒毒株2 :2008年，从中国山东省具有发病表 型的病猪体内分离得到。欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒毒株3 :2008年，从中国北京具有 发病表型的病猪体内分离得到。欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒毒株4 :2007年，从中国福 建省具有发病表型的病猪体内分离得到。欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒毒株5 :2008年， 从中国山东省具有发病表型的病猪体内分离得到。欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒毒株6 : 2008年，从中国山东省具有发病表型的病猪体内分离得到。欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒 毒株7 :2〇08年，从中国山东省具有发病表型的病猪体内分离得到。欧洲类禽H1N1亚型猪 流感病毒毒株8 :2008年，从中国福建省具有发病表型的病猪体内分离得到。
[00701 病猪的发病表型为猪突然发热，精神不振，食欲减退或不食，横卧在一起，不愿活 动，呼吸困难，激烈咳嗽，眼鼻流出粘液。
[0071] 二、引物组的普适性
[0072] 1、提取以上各个毒株的病毒液(病毒浓度为106PFU/100 μ L)的总RNA并反转录为 cDNA。
[0073] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0074] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的1。
[0075] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的1。
[0076] 3、将步骤2得到的PCR扩增产物作为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到 PCR扩 增产物。
[0077] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的2。
[0078] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的2。
[0079] 4、将步骤3的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图5。图 5中，泳 道1至8依次代表毒株1至8，M为TransDNA Marker I (自上至下依次代表7〇〇bp、600bp、 5〇Obp、4〇Obp、3〇Obp、2〇Obp、100bp )。8株毒株经上述检测均可见40〇-5〇〇bp之间的特异条 带。回收所述特异条带并进行测序，均为4 62bp。结果表明，特异引物对的普适性很好。 [0080] 实施例5、应用引物组检测临床样本的方法 。
[0081] -、样品的采集
[0082]病死或扑灭的病猪，取肝、脑或肺组织，或采用棉拭子(鼻腔拭子）取样，2_ 8。〇保 存，待检病料要保持新鲜。 ^
[0083]也可为病死或扑灭的病猪的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子样品。
[0084] 二、样品处理
[0085] 1、组织样品处理：
[0086]称取待检病料l〇〇mg置研磨器中，加入0. 8ml裂解液(含硫氰酸胍〇· 8M、硫氰酸铵 0· 4M、甘油5%、^酚38%的0· 1M醋酸钠缓冲液）研磨，把研磨好的病料移至h 5ml离心管 中，4 C、8000rpm罔心5min，取250 μ 1上清，置于1· 5ml灭菌离心管中，加入750 μ 1裂解液 剧烈振荡混匀，室温放置5min。 '
[0087] 2、棉拭子处理
[0088]将浸液中的棉拭子充分捻动，拧干后弃去拭子，4?、8000rpm离心5min，取 25〇 μ 1 上清液，置于1. 5ml灭菌呙心管中，加入750μ丨裂解液，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
[0089] 3、阴性对照（RNase free 水）
[0090]、取灭菌双蒸水25〇 μ 1，置于L Sml灭菌离心管中，加入75〇 μ丨裂解液，剧烈振荡混 勻，室温放置5min。
[0091] 三、应用引物组检测
[0092] 1、取步骤二得到的各个样本，分别提取总RNA并反转录为cDNA。
[0093] 2、以步骤1得到的d)NA为模板，用引物对甲进行PCR扩增，得到pCR扩增产物。
[0094] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的1。 °
[0095] PCR扩増的反应程序同实施例2的步骤二的1。
[0096] 3、将步骤2得到的PCR扩增产物作为模板，用引物对乙进行pCR扩増，得到^^扩 增产物。
[0097] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的2。
[0098] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的2。
[0099] 4、将步骤3的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行判定，如 出现400-500bp之间的特异条带(具体为462bp扩增带)，表明样品中含有欧洲类禽H1N1亚 型猪流感病毒。
【权利要求】
1. 弓丨物组，包括引物对乙；所述引物对乙由序列表的序列3所示单链DNA分子和序列 表的序列4所示单链DNA分子组成。
2. 如权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述引物组还包括引物对甲；所述引物对 甲由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成。
3. 权利要求1或2所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下（a) 或（b): (a)辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒；（b)辅助鉴定待测样本中是否含有欧 洲类禽H1N1亚型猪流感病毒。
4. 一种试剂盒，包括权利要求1或2所述引物组；所述试剂盒的用途为如下（a)或（b): (a)辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒；（b)辅助鉴定待测样本中是否含有欧洲类禽 H1N1亚型猪流感病毒。
5. 权利要求1或2所述引物组在辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒中的应用。
6. -种辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的 cDNA为模板，用所述权利要求1中的引物对乙进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物、待测 病毒为候选的欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒，如果没有得到所述PCR扩增产物、待测病毒 为候选的非欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒。
7. -种辅助鉴定欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的方法，依次包括如下步骤： (1) 以待测病毒的cDNA为模板，用所述权利要求1中的引物对甲进行PCR扩增； (2) 将完成步骤（1)的体系作为模板，用所述权利要求1中的引物对乙进行PCR扩增， 如果得到PCR扩增产物、待测病毒为候选的欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒，如果没有得到 所述PCR扩增产物、待测病毒为候选的非欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒。
8. 权利要求1或2所述引物组在辅助鉴定待测样本中是否含有欧洲类禽H1N1亚型猪 流感病毒中的应用。
9. 一种辅助鉴定待测样本中是否含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的方法，包括如 下步骤：以待测样本的cDNA为模板，用所述权利要求1中的引物对乙进行PCR扩增，如果得 至IJPCR扩增产物、待测样本疑似含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒，如果没有得到所述PCR 扩增产物、待测样本疑似不含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒。
10. -种辅助鉴定待测样本中是否含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的方法，依次包 括如下步骤： (1) 以待测病毒的cDNA为模板，用所述权利要求1中的引物对甲进行PCR扩增； (2) 将完成步骤（1)的体系作为模板，用所述权利要求1中的引物对乙进行PCR扩增， 如果得到PCR扩增产物、待测样本疑似含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒，如果没有得到 所述PCR扩增产物、待测样本疑似不含有欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒。
【文档编号】C12N15/11GK104232787SQ201310231244
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】刘金华, 蒲娟, 魏延迪, 裴星瑶, 俞晨芳, 张谞霄, 齐鲁 申请人:中国农业大学