一种大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法
【专利摘要】一种采用微生物发酵法大规模生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法。利用微生物发酵法在20KL发酵罐内实现大规模工业化生产抗菌脂肽，其生产周期短，成本低，而且发酵得率高，有助于提高提取的收得率。
【专利说明】一种大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法，属于微生物发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002]近年来我国食品安全问题愈发突出，其中很重要的一个原因就在于食品添加剂的滥用。目前世界食品工业中常用的防腐剂以化学合成防腐剂居多，根据我国《食品添加剂使用标准》GB2760的规定，目前许可使用的32种食品防腐剂中生物添加剂仅有2种，即乳链菌肽(Nisin)和放线菌纳他霉素(Natamycin),其余均为化学合成防腐剂。由于化学防腐剂对人体不同程度存在毒性，其中一些甚至具有诱癌性和致畸性，因此在超标使用的情况下会引起食物中毒，危害人类健康。美国国家卫生基金会和国家癌症研究所新近公布的一份报告表明，在全世界每年罹患癌症的500万人中，有50%左右与食品污染有关，而其中有30%左右受害于食品中的化学防腐剂。因此，研究开发具有重要食品工业用途的新型、高效、广谱和安全的生物防腐剂已经成为食品工业健康持续发展的当务之急。
[0003]虽然国内外对不同来源的微生物天然防腐剂研究很多，现在已经发现细菌、放线菌、酵母菌和霉菌在生长繁殖过程中都能产生抗菌物质，但是在食品工业中实际应用还很少。这主要是因为天然防腐剂抑菌谱窄，如乳链菌肽(Nisin)抑菌效果不够理想，纳他霉素(Natamycin)只能抗真菌与酵母。因此，拓宽天然防腐剂的抑菌谱及提高抑菌效果，增进其抑菌稳定性和适用范围，降低生产成本并提高产量是当今天然食品防腐剂发展的关键所在。
[0004]抗菌脂肽也可称为脂肽抗生素，是一种由脂肪酸链和肽链组成的两性分子，其一端由多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，另一端由脂肪烃链形成亲油基。其特殊的化学结构赋予其表面活性，以及抗病原真菌和细菌等作用。脂肽抗生素作为防腐剂具有天然、高效及低毒的优势，在食品、化`妆品、农业等领域具有广阔的应用前景。
[0005]抗菌脂肽在生物体内天然含量极少，天然资源十分有限，提取效率非常低。而采用化学合成法生产成本很高，价格昂贵，批量生产困难。如何以较低的生产成本实现大规模工业化生产抗菌脂肽成为一个亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006]发明目的:本发明的目的是提供一种采用微生物发酵法大规模生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法。利用微生物发酵法在20KL发酵罐内实现大规模工业化生产抗菌脂肽，其生产周期短，成本低，而且发酵得率高，有助于提高提取的收得率。
[0007]技术方案:一种大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法，所述方法包括以下步骤:
a)以种子发酵罐进行菌种扩大培养:
第一步制作种子培养基:以葡萄糖15g/L,酵母膏3g/L,胰蛋白胨3g/L, MgSO4 5g/L,调节pH6.5，装液系数65%;
第二步以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌种fmbR按照体积比5%进行接种，37°C下培养10小时；
培养条件:种子培养过程中通风量为1.3m3/min,搅拌转速180rpm，罐压
0.09-0.1lMPa ；
b)种子培养结束后，菌种按照体积百分比10%接入发酵罐内，于37°C下培养36小时， 发酵培养基:葡萄糖30g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，Na2HPO4
0.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, FeCl2 0.lmg/L, CaCO3 0.lmg/L，调节 pH6.5，装液系数 65% ；
发酵条件:发酵过程中通风量为10m3/min,搅拌转速120rpm,罐压0.09-0.1 IMPa,流加消泡剂总量为0.05%发酵液体积；
c)发酵结束后，发酵液经过离心分离去除菌体，上清液中加入盐酸调节pH至2.0，充分混匀后静置24小时，然后过滤出絮凝物，用1.5倍初始发酵液体积的乙醇对得到的沉淀进一步处理，处理过程中调节pH至7.0，然后再进行干燥获得粗品抗菌脂肽。
[0008]为了能够实现大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽，发酵结束后检测抗菌脂肽成分的质量浓度平均达到7.4g/L以上。
[0009]为了最终保证生产 效率和粗品抗菌脂肽的品质，所述步骤c中离心分离去除菌体采用碟片式离心机，转速为8000rpm ;在上清液中加入的盐酸浓度为6mol/L。
[0010]有益效果:实现了枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的大规模发酵生产，发酵得率可达到7.0g/L以上，生产周期短，成本相对较低，产品质量稳定。
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于以下实例。
[0012]实施例:
一种大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法，首先以公称容积为2000L的种子发酵罐进行菌种扩大培养。
[0013]制作种子培养基:葡萄糖15g/L,酵母膏3g/L,胰蛋白胨3g/L, MgSO4 5g/L,调节初始PH值为6.5，发酵罐装液系数65%，以南京农业大学分离保藏的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌种fmbR(保藏日期:2008年10月31日，保藏号=CICC 10366)，按照体积百分比5%进行接种，37°C下培养10小时，种子培养过程中通风量为1.3m3/min，搅拌转速180rpm，罐压 0.09-0.1lMPa0
[0014]在2000L种子发酵罐内培养好的菌种按照体积百分比10%接入公称容积为20KL的生产发酵罐内，于37°C下培养36小时，发酵培养基:葡萄糖30g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏 0.5g/L, MgSO4 0.5g/L, Na2HP04 0.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, FeCl2 0.lmg/L, CaCO3 0.lmg/L,调节初始pH值为6.5，发酵罐装液系数65%，发酵过程中通风量为10m3/min，搅拌转速120rpm，罐压0.09-0.llMPa，流加消泡剂总量为0.05%发酵液体积。发酵结束后检测抗菌脂肽成分的质量浓度平均达到7.4g/L。
[0015]发酵液经过碟片式离心机在8000rpm下离心分离去除菌体，在上清液中加入6mol/L盐酸调节pH至2.0，充分混匀后静置24小时，用硅藻土过滤的方法过滤出絮凝物，用1.5倍初始发酵液体积的乙醇对得到的沉淀进一步处理，处理过程中调节pH至7.0，最后真空干燥 获得粗品抗菌脂肽。
【权利要求】
1.一种大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤: a)以种子发酵罐进行菌种扩大培养: 第一步制作种子培养基:以葡萄糖15g/L,酵母膏3g/L,胰蛋白胨3g/L,MgS04 5g/L,调节pH6.5，装液系数65%; 第二步以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌种fmbR按照体积比5%进行接种，37°C下培养10小时； 培养条件:种子培养过程中通风量为1.3m3/min,搅拌转速180rpm，罐压0.09-0.1lMPa ； b)种子培养结束后，菌种按照体积百分比10%接入发酵罐内，于37°C下培养36小时， 发酵培养基:葡萄糖30g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，Na2HPO40.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, FeCl2 0.lmg/L, CaCO3 0.lmg/L，调节 pH6.5，装液系数 65% ； 发酵条件:发酵过程中通风量为10m3/min,搅拌转速120rpm,罐压0.09-0.1 IMPa,流加消泡剂总量为0.05%发酵液体积； c)发酵结束后，发酵液经过离心分离去除菌体，上清液中加入盐酸调节pH至2.0，充分混匀后静置24小时，然后过滤出絮凝物，用1.5倍初始发酵液体积的乙醇对得到的沉淀进一步处理，处理过程中调节pH至7.0，然后再进行干燥获得粗品抗菌脂肽。
2.根据权利要求1所述的大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法，其特征在于:发酵结束后检测抗菌脂肽成分的质量浓度平均达到7.4g/L以上。
3.根据权利要求1所述的大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法，其特征在于:所述步骤c中离心分离去除菌 体采用碟片式离心机，转速为SOOOrpm ;在上清液中加入的盐酸浓度为6mol/L。
【文档编号】C12P21/00GK103757075SQ201310230993
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年6月13日 优先权日:2013年6月13日
【发明者】章金元, 陈德全, 石建伟, 杨晓博 申请人:江苏海华生物科技有限公司, 镇江东方生物工程设备技术有限责任公司