辅助鉴定h9亚型禽流感病毒的引物对及其应用的制作方法

辅助鉴定h9亚型禽流感病毒的引物对及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的引物对及其应用。本发明保护的特异引物对由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成。本发明还保护所述特异引物对在制备辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。本发明还保护所述特异引物对在制备辅助鉴定待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。采用本发明提供的特异引物对辅助鉴定H9亚型禽流感病毒，具有灵敏度高、特异性强、普适性强、所需时间短、成本低等优点，可以对多种临床样本进行检测，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用。本发明对于H9亚型禽流感病毒的临床诊断和流行病控制具有重大价值。
【专利说明】辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的引物对及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的引物对及其应用。

【背景技术】
[0002] H9亚型禽流感是目前危害我国养禽业的主要疫病。H9亚型禽流感病毒可以感染 多种禽和哺乳动物，并可导致禽类发病死亡，严重影响养禽业的健康发展。H9亚型禽流感感 染导致肉鸡生长缓慢和蛋鸡产蛋率下降，给养禽业造成严重的经济损失。虽然我国已全面 采取免疫措施，但H9亚型禽流感仍然在鸡群中反复发生。
[0003] 对于传统的检测方法，如病毒分离、血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验等，费时、 费力。采用鸡胚进行病毒分离培养(需时2-3天)，然后采用血凝抑制试验进行流感病毒亚 型的鉴定（需时1天)，难以做出快速而及时的诊断。此外，H9亚型禽流感病毒基因和抗原 特性的变异，导致常规血清学方法及分子生物学监测方法无法检出流行毒株。因此，建立一 种快速有效的鉴别流行毒株的诊断方法，对于及时采取有效控制措施和防止疫情扩散具有 重要的意义。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一种辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的引物对及其应用。
[0005] 本发明保护特异引物对甲和特异引物对乙。
[0006] 所述特异引物对甲由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单 链DNA分子组成。
[0007] 所述特异引物对乙由与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分 子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成。
[0008] 本发明还保护所述特异引物对甲或所述特异引物对乙在制备辅助鉴定H9亚型禽 流感病毒的试剂盒中的应用。所述H9亚型禽流感病毒具体可为H9N2亚型禽流感病毒。
[0009] 本发明还保护一种辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的试剂盒，包括所述特异引物对 甲或所述特异引物对乙。所述H9亚型禽流感病毒具体可为H9N2亚型禽流感病毒。
[0010] 本发明还保护所述特异引物对甲或所述特异引物对乙在制备辅助鉴定待测样本 中是否含有H9亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。所述H9亚型禽流感病毒具体可为H9N2 亚型禽流感病毒。所述待测样本可为鸡的肝、脑、肺等组织，也可为鸡的口腔拭子、泄殖腔拭 子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为鸡的内脏组织(肝、脑、肺等）或鸡的 内脏组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。
[0011] 本发明还保护一种辅助鉴定待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒的试剂盒， 包括所述特异引物对甲或所述特异引物对乙。所述H9亚型禽流感病毒具体可为H9N2亚型 禽流感病毒。所述待测样本可为鸡的肝、脑、肺等组织，也可为鸡的口腔拭子、泄殖腔拭子等 拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为鸡的内脏组织(肝、脑、肺等）或鸡的内脏 组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。
[0012] 本发明还保护所述特异引物对甲或所述特异引物对乙在辅助鉴定H9亚型禽流感 病毒中的应用。所述H9亚型禽流感病毒具体可为H9N2亚型禽流感病毒。所述应用中不包 括疾病治疗和诊断方法。
[0013] 本发明还保护一种辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测病 毒的cDNA为模板，用所述特异引物对甲或所述特异引物对乙进行PCR扩增，如果得到PCR 扩增产物、待测病毒为候选的H9亚型禽流感病毒，如果没有得到所述PCR扩增产物、待测病 毒为候选的非H9亚型禽流感病毒。所述H9亚型禽流感病毒具体可为H9N2亚型禽流感病 毒。所述PCR扩增产物的大小可为400-500bp，具体可为473bp。所述待测病毒可为H9N2 亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H4N6亚型禽流感病毒、H3N8亚型禽流感病毒、传 染性喉气管炎病毒、减蛋综合症病毒或新城疫病毒。所述方法为非疾病治疗和诊断方法。
[0014] 本发明还保护所述特异引物对甲或所述特异引物对乙在辅助鉴定待测样本中是 否含有H9亚型禽流感病毒中的应用。所述H9亚型禽流感病毒具体可为H9N2亚型禽流感 病毒。所述待测样本可为死亡的鸡的肝、脑、肺等组织，也可为死亡的鸡的口腔拭子、泄殖腔 拭子等拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为鸡的内脏组织(肝、脑、肺等）或鸡 的内脏组织(肝、脑、肺等)加工得到的生鲜食品或熟食。所述应用中不包括疾病治疗和诊断 方法。
[0015] 本发明还保护一种辅助鉴定待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒的方法，包 括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，用所述特异引物对甲或所述特异引物对乙进行 PCR扩增，如果得到PCR扩增产物、待测样本疑似含有H9亚型禽流感病毒，如果没有得到所 述PCR扩增产物、待测样本疑似不含有H9亚型禽流感病毒。所述H9亚型禽流感病毒具体 可为H9N2亚型禽流感病毒。所述PCR扩增产物的大小为400-500bp，具体可为473bp。所 述待测样本可为死亡的鸡的肝、脑、肺等组织，也可为死亡的鸡的口腔拭子、泄殖腔拭子等 拭子样品。所述待测样本还可为食品，所述食品为鸡的内脏组织(肝、脑、肺等）或鸡的内脏 组织(肝、脑、肺等）加工得到的生鲜食品或熟食。所述方法为非疾病治疗和诊断方法。
[0016] 采用本发明提供的特异引物对和方法辅助鉴定H9亚型禽流感病毒，具有灵敏度 高、特异性强、普适性强、所需时间短、成本低等优点，可以对多种临床样本(如临床采集的 样品如口腔拭子、泄殖腔拭子，病毒尿囊液等）进行检测，操作简单、容易推广，便于基层操 作和应用。本发明对于H9亚型禽流感病毒的临床诊断和流行病控制具有重大价值。

【专利附图】

【附图说明】
[0017] 图1为特异性实验的结果。
[0018] 图2为灵敏度实验的结果。
[0019] 图3为普适性实验的结果。

【具体实施方式】
[0020] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。以下实施例中，用于提取总RNA的试剂盒为Viral genome RNA rapid extraction Kit (名称：QIAamp Viral RNA Mini Kit)，厂家QIAGEN，货号52904。以下实施例中，用于 将总 RNA 反转录为 cDNA 的试剂盒为 The reverse transcription(RT)reaction (名称： RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit)，厂家 Fermentas，货号 K1622〇
[0021] H9N2 亚型禽流感病毒（H9N2influenza viruses):参考文献：Yipeng Sun，Juan Pu, Zhanlei Jiang，Tao Guan, Yingju Xia，Qi Xu，Linqing Liu, Bo Ma, Fulin Tian, E. G. Brown, Jinhua Liu. Genotypic evolution and antigenic drift of H9N2influenza viruses in China froml994to2008, Veterinary Microbiologyl46(2010)215 - 225〇
[0022] 鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus):参考文献： Jinling Feng,Yanxin Hu，Zhijun Ma，Qi Yu,Jixun Zhao, Xiaodong Liu,and Guozhong Zhang. Virulent Avian Infectious Bronchitis Virus，People' s Republic of China. Emerging Infectious Diseases. Vol. 18,No. 12,December2012〇
[0023] H4N6亚型禽流感病毒：参考文献：李昀海，赵焕云，张文东，吕粵，岳亮，宋建领，范 泉水，张应国，张富强.云南2株H4N6亚型禽流感病毒株的分离与鉴定畜牧与兽医2011 年第43卷第6期。
[0024] H3N8 亚型禽流感病毒（H3N8influenza viruses):参考文献：Juan Pu，Qin-Fang Liu,Ying-Ju Xia, Yu-Lei Fan, Earl G.Brown, Fu-Lin Tian,Jin-Hua Liu.Genetic analysis of H3subtype influenza viruses isolated from domestic ducks in northern China during2004 - 2005Virus Genes (2009)38:136 - 142〇
[0025] 传染性喉气管炎病毒：参考文献：谢菲，郝满良，王蔚宇，路卫星，王慎行，鸡传染 性喉气管炎人工模拟自然感染模型的建立，黑龙江畜牧兽医，2008年第5期。
[0026] 减蛋综合症病毒：参考文献：刘吉山，沈志强，王艳，李书光，肖跃强，乔建光， 减蛋综合症在樱桃鸭父母代中的流行病学调查.山东畜牧兽医.2010年第31期（总第166 期）。
[0027] 新城疫病毒：参考文献：张鹤晓，赖平安，高志强1，刘环，刘继红，郭晋优，谷 强，张利峰，杨伟，李宁，荧光RT-PCR检测活禽和禽产品中新城疫病毒中强毒株的研究， 中国兽医杂志，2006年（第42卷）第3期。
[0028] 实施例1、特异引物对的设计
[0029] 设计一对用于鉴定H9亚型禽流感病毒的HA基因的引物对如下：
[0030] H9-HA99F (序列表的序列 1) :5'-CATCGGCTACCAATCAACAAAC-3' ；
[0031] H9-HA571R (序列表的序列 2) :5' -GATTATTTGTGTATTGGGCGTC-3'。
[0032] 实施例2、特异引物对的特异性检测
[0033] 实验样本分别为：H9N2亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H4N6亚型禽流 感病毒、H3N8亚型禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒。
[0034] 一、提取各个待测样本（即病毒浓度为106 5EID5(I/100 μ L的病毒液）的总RNA并反 转录为cDNA。
[0035] 二、引物对的特异性
[0036] 1、以步骤一得到的cDNA为模板，用实施例1的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。
[0037] PCR 扩增的反应体系（25μ 1) :2XMix Bufferl2. 5μ 1、H9-HA99F0. 5μ 1、 H9-HA571R0. 5μ l、cDNA2y 1，加双蒸水至 25μ 1。
[0038] PCR 扩增的反应程序：94 °C 5min ;94 °C 45s、59 °C 45s、72 °C 2min，30 个循环； 72〇C lOmin ；4°C 10h〇
[0039] 2、将步骤1的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图1。图1中，1 为H4N6亚型禽流感病毒，2为H3N8亚型禽流感病毒，3为传染性喉气管炎病毒，4为减蛋 综合症病毒，5为新城疫病毒，6为H9N2亚型禽流感病毒，7为鸡传染性支气管炎病毒，Μ为 TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。 结果表明，H9N2亚型禽流感病毒样本在400-500bp之间显示特异条带，其他病毒则无相应 条带。回收所述特异条带并进行测序，为473bp。
[0040] 实施例3、特异引物对的灵敏度检测
[0041] 一、分别提取病毒浓度为 105EID5Q/100 μ L、104EID5Q/100 μ L、103EID5Q/100 μ L、 102EID5Q/100 μ L或10EID5Q/100 μ L的Η9Ν2亚型禽流感病毒的病毒液(按照病毒浓度由高 至低依次命名为病毒液A、病毒液B、病毒液C、病毒液D和病毒液E)的总RNA并反转录为 cDNA。
[0042] 二、引物组合物的灵敏度
[0043] 1、以步骤一得到的cDNA为模板，用实施例1的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。
[0044] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的1。
[0045] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的1。
[0046] 2、将步骤1的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图2。图2中，1 至5依次代表病毒液A、病毒液B、病毒液C、病毒液D和病毒液E，Μ为TransDNA Marker I (自上至下依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。结果表明， 102EID 5Q/100y L及以上的H9N2亚型禽流感病毒的病毒液进行以上步骤后均可在电泳图中 观察到400-500bp之间的特异条带。回收所述特异条带并进行测序，为473bp。
[0047] 实施例4、特异引物对的普适性
[0048] H9N2亚型禽流感病毒毒株1 :1997年，从中国香港具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株2 :1999年，从中国北京市具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株3 :2007年，从中国山东省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株4 :2007年，从中国河北省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株5 :2008年，从中国河北省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株6 :2009年，从中国山东省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株7 :2010年，从中国河北省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株8 :2010年，从中国山东省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株9 :2010年，从中国江苏省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株10 :2011年，从中国山东省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株11 :2011年，从中国广东省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株12 :2011年，从中国河北省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。H9N2亚型禽流感病毒毒株13 :2011年，从中国山东省具有发病表型的病鸡体内分离 得到。
[0049] 病鸡的发病表型为：精神不振，或闭眼沉郁；采食和饮水减少或废绝；张口呼吸， 呼吸困难；拉黄白色稀便，较少的极绿色粪便，有时肛门处粘附淡绿色或白色粪便。
[0050] 1、提取以上各个毒株的病毒液(病毒浓度为106 5EID5(l/100y L)的总RNA并反转录 为 cDNA。
[0051] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用实施例1的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。
[0052] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的1。
[0053] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的1。
[0054] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图3。图3中，泳道 1至13依次代表毒株1至13，Μ为TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、600bp、 500bp、400bp、300bp、200bp、100bp )。13株毒株经上述检测均可见400-500bp之间的特异条 带。回收所述特异条带并进行测序，均为473bp。结果表明，特异引物对的普适性很好。
[0055] 实施例5、应用引物对检测临床样本的方法
[0056] -、样品的采集
[0057] 组织样品：病死或扑灭病禽，取肝、脑、肺等组织；
[0058] 棉拭子：口腔拭子、泄殖腔拭子。
[0059] 2-8°C保存，要求送检病料新鲜。
[0060] 二、样品处理
[0061] 1、组织样品处理
[0062] 称取待检病料100mg置研磨器中，加入0. 8ml裂解液(含硫氰酸胍0. 8M、硫氰酸铵 0. 4M、甘油5%、苯酚38%的0. 1M醋酸钠缓冲液）研磨，把研磨好的病料移至1. 5ml离心管 中，4°C、8000rpm离心5min，取250 μ 1上清，置于1. 5ml灭菌离心管中，加入750 μ 1裂解液， 剧烈振荡混匀，室温放置5min。
[0063] 2、棉拭子处理
[0064] 将棉拭子置于1. 5ml灭菌离心管中，加入0. 3ml PBS缓冲液，静置2小时以上，将 浸液中的棉拭子充分捻动，拧干后弃去拭子，4°C、8000rpm离心5min，取250μ 1上清液，置 于1. 5ml灭菌离心管中，加入750 μ 1裂解液，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
[0065] 3、阴性对照（RNase free 水）
[0066] 取灭菌双蒸水250 μ 1，置于1. 5ml灭菌离心管中，加入750 μ 1裂解液，剧烈振荡混 勻，室温放置5min。
[0067] 三、应用引物组合物检测
[0068] 1、取步骤二得到的各个样本，分别提取总RNA并反转录为cDNA。
[0069] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用实施例1的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。
[0070] PCR扩增的反应体系同实施例2的步骤二的1。
[0071] PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的1。
[0072] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行判定，如 出现400-500bp之间的特异条带(具体为473bp)，表明样品中含有H9亚型禽流感病毒。
【权利要求】
1. 特异引物对甲，由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA 分子组成。
2. 特异引物对乙，由与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和 与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成。
3. 权利要求1所述特异引物对甲或权利要求2所述特异引物对乙在制备辅助鉴定H9 亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。
4. 一种辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对甲或权 利要求2所述特异引物对乙。
5. 权利要求1所述特异引物对甲或权利要求2所述特异引物对乙在制备辅助鉴定待测 样本中是否含有H9亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。
6. -种辅助鉴定待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒的试剂盒，包括权利要求1所 述特异引物对甲或权利要求2所述特异引物对乙。
7. 权利要求1所述特异引物对甲或权利要求2所述特异引物对乙在辅助鉴定H9亚型 禽流感病毒中的应用。
8. -种辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模 板，用权利要求1所述特异引物对甲或权利要求2所述特异引物对乙进行PCR扩增，如果得 到PCR扩增产物、待测病毒为候选的H9亚型禽流感病毒，如果没有得到所述PCR扩增产物、 待测病毒为候选的非H9亚型禽流感病毒。
9. 权利要求1所述特异引物对甲或权利要求2所述特异引物对乙在辅助鉴定待测样本 中是否含有H9亚型禽流感病毒中的应用。
10. -种辅助鉴定待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒的方法，包括如下步骤：以 待测样本的cDNA为模板，用权利要求1所述特异引物对甲或权利要求2所述特异引物对乙 进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物、待测样本疑似含有H9亚型禽流感病毒，如果没有得 到所述PCR扩增产物、待测样本疑似不含有H9亚型禽流感病毒。
【文档编号】C12N15/11GK104232625SQ201310231172
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】蒲娟, 刘金华, 魏延迪, 俞晨芳, 裴星瑶, 齐鲁, 张谞霄 申请人:中国农业大学