一种木糖苷酶Xyl_S及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】一种木糖苷酶Xyl_S及其编码基因与应用，该木糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示。该酶可以采用基因工程方法或者人工合成方法制备，具有β-木糖苷水解酶和β-葡萄糖苷酶双重活性，可以特异性地水解相应的木糖苷键和葡萄糖苷键，可广泛用于化工、食品、生物能源、医药工业方面等应用领域。
【专利说明】-种木糖苷酶Xyl_S及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种木糖苷酶Xyl_S&其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] β -木糖苷酶是一种外切酶，以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以 上的低聚木糖，水解产物为木糖。它是木聚糖降解的关键酶之一，有着重要的工业应用价 值。在能源工业中，工农业废弃物中的木聚糖可被木聚糖酶系转化为木糖，而木糖又可被细 菌及真菌转化成酒精等有价值的燃料；在医药行业中，木聚糖酶系水解特定底物可产生在 医药行业具有重要应用价值的中间转化产物。例如，Patel等人利用Moraxella. sp@ -木 糖苷酶水解10-去乙酰紫杉醇木糖苷的7位木糖残基，得到重要的中间产物10-去乙酰紫 杉醇，为紫杉醇的合成开辟了一条崭新的途径（US005700669A ;EP0668360B1)。
[0003] 纤维化纤维微细菌是一种能够高效利用纤维素、半纤维素的放线菌，其 可以产生多种水解酶，如 Shi-Hsiang Shen 等人（The Journal of Biological Chemistry， 1991，266(2):1058-1063)从此菌株发酵液上清中分离得到了 β -1，3-葡萄糖苷酶，并对其进行了克隆和外源表达；Petra Tiels等人（Nature Biotechnology2012, 30:1225-1231)对此菌株所产生的5个甘露糖苷酶进行了克隆和外源 表达。但目前为止，并没有获得其中木糖苷酶的报道。我们在前期工作中分离到一株纤维 化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans)菌株 F16 (CCTCC M2013201)，通过深入研 究发现其培养液上清能够分泌一种木糖苷酶，该酶具有β-木糖苷水解酶和β-葡萄糖苷 酶水解酶双重活性，可以特异性水解相应的木糖苷键和葡萄糖苷键，同时具有广泛的底物 特异性，可水解多种木糖苷底物和葡萄糖苷底物，例如木寡糖、4-硝基苯基-β -D-吡喃木 糖苷（ρΝΡ- β -Xyl )、4_硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷（ρΝΡ- β -Glu)、7-木糖苷紫杉烷、黄 芪甲苷，以及人参皂苷Rbl、Rb2、Re等。这些优良的水解性质使其有可能具有非常高的工业 利用价值。因此，如何大量获得该酶或含有该酶的菌已经成为制约其工业利用的关键问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种木糖苷酶Xyl_s及其编码基因与应用，本发明通过基因 表达后大量产生具有广泛底物特异性的木糖苷酶Xyl_S，用以水解木糖苷化合物生成木糖 及相应的苷元，亦可用于水解葡萄糖苷化合物生成葡萄糖及相应的苷元。
[0005] 本发明提供了一种木糖苷酶Xyl_S，其氨基酸序列包含如序列表中SEQ ID N0. 2 所示序列的至少1642个氨基酸序列；优选SEQ ID NO. 2示序列的第24个氨基酸残基到第 1151个氨基酸残基在内的至少1128个氨基酸序列，进一步优选包括SEQ ID N0. 2所示序列 的第87个氨基酸残基到第1119个氨基酸残基在内的至少1033个氨基酸序列。
[0006] 本发明提供了一种木糖苷酶Xyl_S的编码基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的至少4929个核苷酸；优选具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列 的第72个核苷酸到第3453个核苷酸在内的至少3372个核苷酸；进一步优选具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的第261个核苷酸到第3357个核苷酸在内的至少3099个核苷酸。
[0007] 本发明提供了一种含有所述编码基因的重组载体，该重组载体是大肠杆菌表达载 体、酿酒酵母表达载体、毕赤酵母表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状 真菌表达载体中的任意一种。
[0008] 本发明提供了一种含有所述重组载体的重组细胞株，该重组细胞株的宿主细胞是 大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、丝状真菌的任意一种。该重组细胞 株可以表达木糖苷酶Xyl_S，既可以胞内表达，也可以分泌到细胞外。
[0009] 本发明所涉及的基因是通过DNA重组技术从纤维化纤维微细菌 (Cellulosimicrobium cellulans)菌株 F16 (CCTCC M2013201)的染色体中克隆，并经连接 在pCold IV表达载体后在大肠杆菌中过量表达。经过量表达的木糖苷酶Xyl_S既可以分 泌到细胞外，也可以在细胞内表达。其在SDS-PAGE上呈现的分子量约为140KDa，其最佳反 应pH为7. 5,有效作用的pH范围为5. 5?9. 5,并且在20?50°C均具备良好的催化活性。
[0010] 由于密码子的简并性，所有与SEQ ID NO. 1同源性低至约60%的简并序列也能编 码出SEQ ID N0. 2所述的序列。另外，任何基因通过DNA重组技术可以改变其序列，从而产 生各种不同的突变体。这些突变体所表达的蛋白质通常具有类似的性质。当基因或蛋白质 序列达到一定的同源性时，它们所表达的蛋白质的性质随同源性增加而更为相似。本发明 涉及的基因及其产物也具有相同的特点。当同源性达到80%以上时，类似基因所表达的蛋 白质将会具有催化木糖苷化合物水解为木糖和苷元的性质。
[0011] 由于上述技术方案的使用，本发明的有益效果是：利用本发明的基因进行表达，获 得木糖苷酶Xyl_S或含该酶的宿主细胞，能有效地催化木糖苷化合物以及葡萄糖苷化合物 的水解，可应用于各种工业，例如用于生物质转化，如用于由包含生物质的纤维素生产燃料 乙醇的过程中，用于饲料组合物中，提高动物对粗纤维的利用率，或用于面包制造面团中， 还可以用于医药中间体的获得，如水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇获得10-去乙酰紫杉醇， 同时水解黄芪甲苷iv上的β-木糖苷键和β-葡萄糖苷键从而获得相应苷元，水解掉人参 皂苷Rbl、Rb2或Re上的木糖苷和葡萄糖苷得到相应人参皂苷CK、Compound Y、pro等等。
[0012] 本发明提供的木糖苷酶Xyl_s或重组细胞株应用于医药，生物，农业，能源等领 域，将木糖苷化合物(或葡萄糖苷化合物）中的糖苷键水解，获得相应的苷元。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1 :聚丙烯酰胺凝胶电泳分析分离出纯的木糖苷酶Xyl_S，其中，MUX为4-甲 基伞形酮酰-β -D-吡喃木糖苷，其糖苷键经水解后经365nm激发光激发后出现荧光，从 而实现对各个组分中β-木糖苷酶的监测和酶谱分析；左图：2%_15%梯度Native PAGE， 考染；中图：2%-15%梯度Native PAGE，MUX染色；右图：10%SDS-PAGE，考染；样品1 一BSA ferrintin ；2一发酵液上清；3-多酶复合物；4一木糖苷酶Xyl_S ;
[0014] 图2 :纯酶催化ρΝΡ-β -D-Xyl水解，底物浓度对应相应初始反应速率的米氏曲 线.
[0015] 图3 :纯酶催化ρΝΡ-β -D-Glu水解，底物浓度对应相应初始反应速率的米氏曲 线.
[0016] 图4 :琼脂糖电泳检测PCR产物，其中，Μ为标准品，λ噬菌体Hind III降解物；1 为克隆出的Xyl_S基因；
[0017] 图5 :纯化后的重组酶Xyl_S ;
[0018] 图6 :Xyl_S纯酶转化纯度为99%的10DAXT结果，其中，10DAXT为7-木糖-10-去 乙酰基紫杉醇，10DAT为10-去乙酰基紫杉醇；
[0019] 图7 :Xyl_S纯酶转化7-木糖紫杉烷混合物的结果，其中，10DAXT为7-木 糖-10-去乙酰基紫杉醇，10DAT为10-去乙酰基紫杉醇，10DAXC为7-木糖基-10-去乙酰 三尖杉宁碱，10DAC为10-去乙酰三尖杉宁碱，10DAXTC为7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇C， 10DATC为10-去乙酰基紫杉醇C ;
[0020] 图8 :水解产物的质谱图，其中，A为10-去乙酰三尖杉宁碱，B为10-去乙酰基紫 杉醇；
[0021] 图9 :纯酶转化黄芪甲苷IV生成环黄芪醇TLC图。
【具体实施方式】
[0022] 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
[0023] 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0024] 本发明所依赖的遗传资源是纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans)菌株F16,保藏号为CCTCC M2013201，保存于中国典型培养物保藏中心。
[0025] 实施例1 :糖苷酶的纯化及其活性亚基的分离
[0026] 1、纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans)菌株 F16 的培养
[0027] 从培养好的菌种斜面(木聚糖培养基，含1. 5%琼脂)挑取约1cm2见方的菌苔，接种 至IJ 100ml无菌的麦麸液体培养基中（木聚糖培养基成分：木聚糖2%，酵母膏0. 2%，蛋白胨 0.2%，1(2册040.1%)，301：、160印111摇瓶培养2(1。
[0028] 2、木糖苷酶Xyl_S的分离纯化
[0029] 10000g/min，离心2min后收集上清即为粗酶液。以对硝基苯基-β-D-木糖苷 (pNP-Xyl)作为特异性生色底物对有β-木糖苷酶活性的蛋白进行跟踪。一个酶单位定义 为在30°C，ρΗ7. 5,以pNP-Xyl为底物，lh内催化产生1 μ mol对硝基酚所需要的酶量。依 次经过硫酸铵沉淀，收集20%-40%阶段的沉淀组分；Toyopearl DEAE650M离子交换柱，收集 0· 5?0· 7mol/L NaCl阶段洗脱组分；S印hacryl S-200HR凝胶过滤层析柱，收集分子量在 30kDa?200kDa之间的活性组分；将上述活性组分过S〇urcel5Q柱分离，收集比活性最高 的酶活组分，即得纯的木糖苷酶Xyl_S (图1)。
[0030] 实施例2 :木糖苷酶Xyl_S编码基因的克隆
[0031] 以纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans)菌株F16基因组DNA为 模板，PCR扩增木糖苷酶Xyl_S的编码基因4929bp (见图4)，克隆至pMD-T载体上，测序验 证结果显示，与SEQ ID NO. 1所示序列一致。PCR反应体系以及反应条件见下表：
[0032]
【权利要求】
1. 一种木糖苷酶Xyl_S，其特征在于：其氨基酸序列包含如序列表中SEQ ID NO. 2所示 序列的至少1642个氨基酸序列。
2. 按照权利要求1所述木糖苷酶Xyl_S，其特征在于：其氨基酸序列包含SEQ ID NO. 2 所示序列的第24个氨基酸残基到第1151个氨基酸残基在内的至少1128个氨基酸序列。
3. 按照权利要求2所述木糖苷酶Xyl_S，其特征在于：其氨基酸序列包含SEQ ID NO. 2 所示序列的第87个氨基酸残基到第1119个氨基酸残基在内的至少1033个氨基酸序列。
4. 一种木糖苷酶Xyl_S的编码基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的至少4929个核苷酸。
5. 按照权利要求4所述木糖苷酶Xyl_S的编码基因，其特征在于：所述基因的核苷酸 序列具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的第72个核苷酸到第3453个核苷酸在内的至少 3372个核苷酸。
6. 按照权利要求5所述木糖苷酶Xyl_S的编码基因，其特征在于：所述基因的核苷酸 序列具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的第261个核苷酸到第3357个核苷酸在内的至 少3099个核苷酸。
7. -种含有权利要求4所述编码基因的重组载体。
8. 按照权利要求7所述的重组载体，其特征在于：该重组载体是大肠杆菌表达载体、酿 酒酵母表达载体、毕赤酵母表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌 表达载体中的任意一种。
9. 一种含有权利要求7所述重组载体的重组细胞株。
10. 按照权利要求9所述的重组细胞株，其特征在于：该重组细胞株的宿主细胞是大肠 杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、丝状真菌的任意一种。
11. 按照权利要求9所述的重组细胞株，其特征在于：该重组细胞株表达木糖苷酶Xyl_ S，既能够胞内表达，也能够分泌到细胞外。
12. -种应用，其特征在于：权利要求1所述木糖苷酶Xyl_S或权利要求9所述重组 细胞株应用于医药，生物，农业，能源领域，将木糖苷化合物中的糖苷键水解，获得相应的苷 J Li 〇
13. -种应用，其特征在于：权利要求1所述木糖苷酶Xyl_S或权利要求9所述重组细 胞株应用于医药，生物，农业，能源领域，将葡萄糖苷化合物中的糖苷键水解，获得相应的苷 J Li 〇
【文档编号】C12N15/63GK104232605SQ201310251300
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月21日 优先权日:2013年6月21日
【发明者】杨凌, 窦同意, 栾宏伟, 刘兴宝, 李世阳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所