一种犬瘟热和犬细小病毒双色荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种犬瘟热和犬细小病毒的双色荧光定量PCR检测试剂盒，其中检测方法为：先利用本发明试剂盒的核酸提取液对样本进行预处理并提取核酸，然后用双色荧光定量PCR试剂盒在一个反应体系中同时对犬瘟热和犬细小病毒的核酸进行检测，只需一步检测便可判断待测样品中是否存在犬瘟热、犬细小两种病毒，以及对病毒拷贝数进行定量。该检测方法检测效率高、特异性和敏感性较好，能够满足动物疫病临床检测和疫情监控的目的。
【专利说明】—种犬瘍热和犬细小病毒双色荧光定量PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种双色荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种同时检测犬瘟热和犬细小病毒的双色荧光定量PCR检测试剂盒，本发明属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]犬痕热病毒(Caninedistempervirus,CDV)和犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)是危害犬最严重的传染性疫病病原之二，所引起的疫病无特效药物难于防治，治愈率很低，治愈者也有严重的后遗症，严重的可导致大量犬只急性死亡。
[0003]犬瘟热病毒(Caninedistempervirus，CDV)是一种单链RNA病毒，宿主为犬科动物和鼬科动物，主要通过空气和飞沫水平传播。病犬是重要的传染源，并通过尿液长期排毒，污染周围环境；不同年龄、性别和品种的犬均可感染。感染CDV表现症状多种多样，与病毒毒力、环境条件、宿主的年龄及免疫状态有关，主要可分为超急性型、急性型、消化道症状、神经症状和皮肤症状5种特征性类型，一旦出现特征性症状，则预后极差。而CDV引起的轻微病变，局限于呼吸道和眼部而难于发现，使犬瘟的临床诊断很困难。CDV感染病型复杂多样，I临床上诊断很困难，易与上呼吸道感染、犬传染性肝炎、犬冠状病毒感染等相混淆，必须根据病毒分离鉴定来确诊。 [0004]⑶V感染的实验室诊断方法主要有以下几个方面:一、血液变化:包括淋巴细胞增殖、血小板减少和再生障碍性贫血；二、急性感染中可以从血涂片(特别是淋巴细胞，偶尔中性粒细胞)的细胞内发现包涵体；三、骨髓抽出物的检查，也可发现细胞内包涵体；四、从结膜上皮细胞中也可检出犬瘟热包涵体；CDV的其他的检测方法包括:免疫学方法、用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中的IgG和IgM抗体和病毒分离，这些检测方法需要特殊的设备以及样品的准备，且检测过程复杂、难度大以及精确度低。
[0005]犬细小病毒(Canine Parvovirus, CPV)为无囊膜,单负股的DNA病毒，由3个结构蛋白VP1、VP2和VP3组成。其中VP2是其保护性颗粒抗原。该病毒有2种不同的型，SPCPV-1型和CPV-2型。CPV-1型，又称犬微小病毒(MVC)，可引起幼犬肺炎、心肌炎和肠炎，或经胎盘感染引起胚胎吸收和胎儿死亡，但MVC仅引起40日龄以下的幼犬出现临床症状。CPV-2作为犬的一个新型病毒与猫泛白细胞减少症病毒(FPV)很相近。犬细小病毒对犬具有高度的接触性传染性，各种年龄的犬均可感染。但以刚断乳至90日龄的犬发病较多，病情也较严重。幼犬有的可呈现心肌炎症状而突然死亡。据临床发病犬的种类来看，纯种犬及外来犬比土种犬发病率高。本病一年四季均可发生，但以天气寒冷的冬春季多发。病犬的粪便中含毒量较高。
[0006]CPV感染的诊断方法主要根据血常规检测结果和本病的主要症状进行初步诊断。血常规检测红细胞压积增加，白细胞值正常或偏低，常提示病毒病。病犬排泄番茄汁样或酱油样带腥臭气味的血便是本病的特征性症状，可作为初诊依据。此外，犬细小病毒病的诊断多采用犬细小病毒胶体金快速诊断试纸进行，此法简便快速，但是往往准确率不高。
[0007]综上所述，常规的犬瘟热和犬细小病毒的实验室检验一般都是根据免疫反应的原理用ELISA或者金标法进行检测等。此外针对上述两种病毒虽然还可以用PCR扩增技术进行检测，但首先需要在样品中提取上述病毒核酸，犬瘟热病毒为一种RNA病毒，需要提取RNA，再以此产物为模板进行逆转录，最后对样品采用预先设计好的引物进行扩增；犬细小病毒是DNA病毒，可以直接提取DNA进行扩增。根据预设片段如果扩增出相应的片段则说明病毒的存在，敏感性要高于上述血清学检测方法。然而用普通PCR的方法进行犬瘟热和犬细小病毒核酸 检测，虽然灵敏度有所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。而且，犬瘟热和犬细小病毒常以单独或混合感染的方式感染动物，发病率和死亡率都较高，需要快速检测，做到早诊断、早隔离、早防治才能到达好的效果。
[0008]多色荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因，而每个目的基因采用的不用波长的荧光探针进行检测。荧光标记的探针有多种，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。
【发明内容】
[0009]为了解决上述问题，本发明通过多色荧光定量PCR技术，提供了一种检测效率高、特异性和敏感性较好、可同时检测CDV和CPV两种病毒的方法及检测试剂盒。
[0010]本发明的目的在于提供一种犬瘟热和犬细小病毒双色荧光定量PCR检测试剂盒。
[0011]本发明所采取的技术方案是:
一种犬瘟热和犬细小病毒双色荧光定量PCR检测试剂盒包括如下成分:病毒RNA核酸提取液、病毒DNA核酸提取液、反转录酶系、Taq酶系、双色荧光定量PCRMIX、阳性质控品、阴性质控品、DEPC水，双色荧光定量PCR MIX中含有IOX双色荧光定量PCR buffer、dNTPs、及犬瘟热病毒和犬细小病毒的特异性引物及双色探针，序列分别为:
犬瘟热病毒:
上游引物:CDV-F:5’ - GCAAGCGAGGAITGAGGGTAT-3’ (SEQ ID N0.1)；
下游引物:CDV-R:5，- GGCCTATGGGACACACTCAAA-3，(SEQ ID N0.2)；
荧光探针:CDV_P:5’ -FAM- CACCGACCATCCAGACGITGCTCCT-TAMRA-3’ (SEQ ID N0.3)
犬细小病毒:
上游引物:CPV-F:5，- CGTCTACACAAGGGCCAITTA-3’ (SEQ ID N0.4)；
下游引物:CPV-R:5，- CCATGITGTCTACCAAATGCAT-3，(SEQ ID N0.5)；
荧光探针:CPV-P:5，-VIC- CGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCA-TAMRA-3’ (SEQ ID N0.6)；其中，犬痕热病毒的突光探针报告基团为FAM,犬细小病毒的突光探针报告基团为VIC，淬灭基团均为TAMRA。
[0012]进一步的，上述病毒RNA核酸提取液每1000mL中含有:异硫氰酸胍480g，0.1MTris-HCl (pH6.4) 500mL，0.2M EDTA (pH8.0) 120mL，余量为水；
进一步的，上述病毒DNA核酸提取液含有20mM NaOHUOmM Tris-HCl (pH8.0)、浓度为2%(w/v)的 Chelex-100、余量为水。
[0013]进一步的，上述双色荧光定量PCR MIX的组成如下:
10 X双色荧光定量PCR buffer 2.5 u L
CDV-F (IOuM)I u L
【权利要求】
1.一种犬瘟热和犬细小病毒双色荧光定量PCR检测试剂盒，包括如下成分:病毒RNA核酸提取液、病毒DNA核酸提取液、反转录酶系、Taq酶系、双色荧光定量PCR MIX、阳性质控品、阴性质控品和DEPC水，其特征在于:所述双色荧光定量PCR MIX中含有IOX双色荧光定量PCR buffer, dNTPs、及犬瘟热病毒和犬细小病毒的特异性引物及双色探针，序列分别为: 犬瘟热病毒:
上游引物:CDV-F:5’ - GCAAGCGAGGAITGAGGGTAT-3’ ；
下游引物:CDV-R:5’ - GGCCTATGGGACACACTCAAA-3’ ； 荧光探针:
CDV-P:5’ -FAM- CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-TAMRA-3’ ； 犬细小病毒:
上游引物:CPV-F:5’ - CGTCTACACAAGGGCCAITTA-3’ ；
下游引物:CPV-R:5’ - CCATGITGTCTACCAAATGCAT-3’ ； 荧光探针:
CPV-P:5’ -Vic- CGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCA-TAMRA-3’ ； 犬瘟热病毒的荧光探针报告基团为FAM，犬细小病毒的荧光探针报告基团为VIC，淬灭基团为TAMRA。
2.根据权利要求1所述的一种犬`瘟热和犬细小病毒双色荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述病毒RNA核酸提取液每1000mL中含有:异硫氰酸胍480g，0.1M pH 6.4的Tris-HCl 500mL，0.2M pH8.0 的 EDTA 120mL，余量为水。
3.根据权利要求1所述的一种犬瘟热和犬细小病毒双色荧光定量PCR检测试剂盒，特征在于:所述病毒DNA核酸提取液含有20mM NaOHUOmM pH8.0的Tris_HCl、浓度为2%(w/v)的Chelex-100、余量为水。
【文档编号】C12Q1/70GK103614494SQ201310562660
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】魏文康, 徐贵峰, 谭婉红, 林立峰, 袁洁, 吕殿红, 翟少伦, 温肖会, 周秀蓉, 贾春玲, 陈琴苓 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所