一种抑制IRS2基因表达的shRNA及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制IRS2基因表达的shRNA及应用，属于基因工程【技术领域】。本发明提供的shRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1。本发明还提供了一种抑制IRS2基因表达的shRNA干扰载体。根据克隆经对比分析后的猪源IRS2基因保守序列，合成带有BamH?Ⅰ和HindⅢ酶切位点干扰片段，并将干扰片段连接到经过BamH?Ⅰ和HindⅢ线性化的质粒载体上，经筛选后获得有效干扰载体。本发明提供的shRNA及其干扰载体，能够有效抑制IRS2基因的表达，影响细胞的糖脂代谢，为2型糖尿病模型猪的构建奠定基础。
【专利说明】—种抑制IRS2基因表达的shRNA及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抑制IRS2基因表达的ShRNA及应用，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA (double stranded RNA, dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，它能够抑制正常生物体内特定基因的表达。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)的反义链和多种核苷酸酶作用后会形成具有结合和切割mRNA作用的沉默复合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC),从而最终介导RNA干扰过程。与耗时较长的基因敲除技术相比，RNAi可在较短时间内可控性地关闭多达10个基因。藉此灵活快速的特点，RNAi技术已经成为研究基因功能的重要工具，并在遗传性疾病、病毒病和肿瘤病的致病机理和治疗方面发挥重要作用。
[0003]2型糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)是一种复杂的代谢紊乱疾病，其发病率正随着人口老龄化，而逐年升高。2型糖尿病主要的发病机制为外周胰岛素抵抗与胰腺β细胞功能发生障碍，而这主要是有遗传缺陷引起的。胰岛素受体底物(insulin receptorsubstrates, IRSs)蛋白处于 胰岛素信号通路的枢纽位置,通过自身磷酸化作用招募并结合下游的许多信号转导分子，将胰岛素信号传递、发散到下级网络，在维持细胞正常的生理功能上起到重要的作用，IRSl和IRS2基因的缺陷是2型糖尿病发病的主要诱因。原因在于IRSl和IRS2功能的缺失会引起机体生长发育缓慢，以及对胰岛素敏感性的降低和β细胞分泌功能障碍。
[0004]在目前以小鼠为主利用转基因技术产生的2型糖尿病模型中，基本上都是具有胰岛素抵抗以及β细胞失活的特征。敲除IRSl基因的小鼠表现出生长发育缓慢以及一定的胰岛素抵抗现象，敲除IRS2基因的小鼠在出生后直接表现为胰高血糖症以及β细胞分泌功能障碍，导致生成2型糖尿病，而同时敲除IRSl和IRS2基因的小鼠出生前就会死亡。但是，小鼠模型还是具有很多局限性，小鼠在遗传水平与表型上不能很好地模拟人类疾病，而且小鼠寿命较短，不能作为长期患病的研究目标。作为糖尿病的动物模型，小鼠对于葡糖以及胆固醇食物的反应与人类也存在较大差异。
[0005]猪和人在解剖学、生理学以及代谢特点方面均有很大的相似性，包括心脏血管的功能与结构，脂蛋白的分布，体型，发胖的趋势以及杂食的习惯等。这使得猪作为研究2型糖尿病的模式动物具有很多优点。譬如，患有2型糖尿病的猪会伴随着动脉粥样硬化，发病的解剖学位置与人类相同，而且与人类相应疾病的组织病理学特征是相似的。由于患有2型糖尿病的猪所表现出来的代谢异常与人类更加接近，因此建立有价值并且稳定的2型糖尿病猪模型是非常必要的。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种抑制猪IRS2基因表达的shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不，王要在抑制猪源IRS2基因表达制品中应用。。
[0007]本发明还提供了一种shRNA干扰载体的制备方法，步骤如下:
[0008](1)在SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列两端加入合成带有BamH I和Hind III酶切位点，获得干扰片段；
[0009](2)将步骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamH I和Hind III线性化的质粒载体上，获得干扰载体。
[0010]具体步骤如下:
[0011](1)在SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列两端加入合成带有BamH I和Hind III酶切位点，获得shRNA干扰片段；
[0012](2)将步骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamH I和HindIII线性化的p-Genesil 1.0质粒载体上,获得干扰载体p-Genesil_shIRS2。
[0013]本发明提供的shRNA干扰载体的制备方法在抑制IRS2基因表达制品中的应用。
[0014]具体而言，对比人的IRS2基因序列和猪的基因组，根据保守区域序列设计引物，克隆猪IRS2的保守序列。
[0015]根据克隆获得猪IRS2序列，通过Ambion网站分别设计4对干扰片段，分别合成带有BamH I和Hind III酶切位点的单链shRNA干扰片段，复性成双链后，连接到经过BamH I和Hind III线性化的p-Genesil 1.0载体。构建并筛选的有效干扰片段为shIRS2。
[0016]本发明的优点在于，干扰载体p-Genesil-shIRS2具有非常明显地敲低猪源IRS2基因表达的作用，对于构建2型糖尿病猪模型具有重要作用。因shRNA片段在体内一段时间会被降解，本发明研究成果对血糖浓度较低者采用RNA干扰技术提高血糖浓度具有借鉴意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1:猪与人IRS2基因3’ UTR序列比对结果及有效干扰片段的筛选。
【具体实施方式】
[0018]以下结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特别说明，均为购自常规生化试剂商店。
[0019]实验所用的巴马仔猪均来自东北农业大学实验基地猪场，实验所用的菌株质粒包括干扰载体 pGenesill.0 (Shen, Y.M.，X.C.Yang, et al.(2010)."Growth inhibitioninduced by short hairpin RNA to silence survivin gene in human pancreatic cancercells."Hepatobiliary Pancreat Dis Int9 (I): 69-77.)、猪胎儿原代成纤维细胞、大肠杆菌DH5a均来自东北农业大学胚胎工程实验室。反转录试剂盒、LA Taq酶、SYBR荧光实时定量PCR试剂盒、T4连接酶、PMD-18T载体、3’ RACE试剂盒、质粒大提试剂盒均购自Takara试剂公司；胶回收试剂盒购自Axygen公司；质粒小量试剂盒购自天根生物有限公司、DNA marker购自Trans gene公司；胎牛血清、DMEM培养基、非必需氨基酸、谷氨酰胺、Lipofectamin LTX and plus均购自Gibico公司；DNA测序由上海立菲生物技术有限公司完成。[0020]SEQ ID N0.1:ggtttctggagatggagatgcgtgtgctgtccgcatctccatctccagaaacc
[0021]实施例1:
[0022]猪IRS2基因的克隆及筛选
[0023](I)猪IRS2基因3’UTR区域的克隆
[0024]人的IRS2基因序列为已知的，将人IRS2基因与猪的基因组进行比对，根据保守区域序列设计引物，以2d巴马猪肝脏组织cDNA为模板，克隆得到猪IRS2基因的保守序列，PCR 反应体系 20ul:cDNA 0.5ul，引物 2ul，rTaq 0.5ul, 10XPCR Buffer 2.5ul, dNTPs2ul, dH2017.5uL.PCR 反应程序为:94°C 5min ；94°C 30s, 59.3°C 30s, 72°C 30s，35 个循环；72°C IOmin0 PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中观察结果，将目的条带胶回收，连接PMD-18T克隆载体进行测序。得到无突变序列进行3’ RACE扩增，标准操作按照Takara公司试剂盒说明书进行。
[0025]结果显示，获得的片段为950bp，具有PolyA结构，位于猪11号染色体，不编码氨基酸，与人IRS2基因3’UTR序列的相似性达到了 73.08% (图1A)。将p-Genesil-shIRS2-l_4转染猪肝脏细胞，Real-time PCR检测干扰效率。实验结果表明，shIRS2_l显著敲低了 IRS2基因的表达，干扰效率达到60% (图1B)。
[0026]实施例2:
[0027]p-Genesil_shIRS2 干扰载体的构建
[0028]根据克隆获得猪IRS2序列，通过Ambion网站分别设计4对干扰片段(表1)，分别合成带有BamH I和Hind III酶切位点的单链shRNA干扰片段，复性成双链后，连接到经过BamH I和Hind III线性化的p-Genesill.0载体。经过测序正确之后，构建成功的载体为p-Genensil-shIRS2-l_4。筛选出的有效干扰载体为 p-Genensil-shIRS2_l。
[0029]表1猪IRS2基因的干扰片段序列
[0030]
【权利要求】
1.一种抑制IRS2基因表达的shRNA，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述的shRNA在抑制猪源IRS2基因表达制品中应用。
3.一种含有权利要求1所述的shRNA干扰载体的制备方法，其特征在于，步骤如下: (1)在SEQID N0.1所示的核苷酸序列两端加入BamH I和Hind III酶切位点，得到干扰片段； (2)将步骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamHI和HindIII线性化的质粒载体上，获得干扰载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)在SEQID N0.1所示的核苷酸序列两端加入BamH I和Hind III酶切位点，得到shRNA干扰片段；(2)将步骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamHI和Hind III线性化的p-Genesil1.0质粒载体上,获得干扰载体p_Genesil_shIRS2。
5.权利要求3或4 所述方法在抑制猪源IRS2基因表达制品中应用。
【文档编号】C12N15/85GK103602682SQ201310562507
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】孔庆然, 黄天晴, 刘忠华 申请人:东北农业大学