一种抑制IRS1基因表达的shRNA及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制IRS1基因表达的shRNA及应用，属于基因工程【技术领域】。本发明提供的shRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1。通过与具有IRS2基因的质粒载体进行连接，本发明还提供了一种具有同时敲低猪源IRS1和IRS2基因表达的shRNA干扰载体。猪肝脏细胞IRS基因表达实验的结果显示，shRNA干扰载体分别将猪的IRS1基因和IRS2基因敲低了78%和64%。同时，IRS基因表达水平的敲低对猪肝脏细胞的糖脂代谢产生影响，提高了猪肝脏细胞的血糖浓度。本发明不仅为构建2型糖尿病模型猪奠定基础，还对如何提高猪血糖浓度进行了有益探索。
【专利说明】—种抑制IRS1基因表达的shRNA及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抑制IRSl基因表达的ShRNA及应用，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA (double stranded RNA, dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，它能够抑制正常生物体内特定基因的表达。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)的反义链和多种核苷酸酶作用后会形成具有结合和切割mRNA作用的沉默复合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC),从而最终介导RNA干扰过程。与耗时较长的基因敲除技术相比，RNAi可在较短时间内可控性地关闭多达10个基因。藉此灵活快速的特点，RNAi技术已经成为研究基因功能的重要工具，并在遗传性疾病、病毒病和肿瘤病的致病机理和治疗方面发挥重要作用。
[0003]2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一种复杂的代谢紊乱疾病,其发病率正随着人口老龄化，而逐年升高。2型糖尿病主要的发病机制为外周胰岛素抵抗与胰腺β细胞功能发生障碍，而这主要是有遗传缺陷引起的。胰岛素受体底物(insulin receptorsubstrates, IRSs)蛋白处于胰岛素信号通路的枢纽位置,通过自身磷酸化作用招募并结合下游的许多信号转导分子，将胰岛素信号传递、发散到下级网络，在维持细胞正常的生理功能上起到重要的作用，IRSl和IRS2基因的缺陷是2型糖尿病发病的主要诱因。原因在于IRSl和IRS2功能的缺失会引起机体生长发育缓慢，以及对胰岛素敏感性的降低和β细胞分泌功能障碍。·
[0004]在目前以小鼠为主利用转基因技术产生的2型糖尿病模型中，基本上都是具有胰岛素抵抗以及β细胞失活的特征。敲除IRSl基因的小鼠表现出生长发育缓慢以及一定的胰岛素抵抗现象，敲除IRS2基因的小鼠在出生后直接表现为胰高血糖症以及β细胞分泌功能障碍，导致生成2型糖尿病，而同时敲除IRSl和IRS2基因的小鼠出生前就会死亡。但是，小鼠模型还是具有很多局限性，小鼠在遗传水平与表型上不能很好地模拟人类疾病，而且小鼠寿命较短，不能作为长期患病的研究目标。作为糖尿病的动物模型，小鼠对于葡糖以及胆固醇食物的反应与人类也存在较大差异。
[0005]猪和人在解剖学、生理学以及代谢特点方面均有很大的相似性，包括心脏血管的功能与结构，脂蛋白的分布，体型，发胖的趋势以及杂食的习惯等。这使得猪作为研究2型糖尿病的模式动物具有很多优点。譬如，患有2型糖尿病的猪会伴随着动脉粥样硬化，发病的解剖学位置与人类相同，而且与人类相应疾病的组织病理学特征是相似的。由于患有2型糖尿病的猪所表现出来的代谢异常与人类更加接近，因此建立有价值并且稳定的2型糖尿病猪模型是非常必要的。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种抑制猪IRSl基因表达的shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不，王要用于制备抑制猪源IRSl基因的制品。
[0007]本发明提供的shRNA以干扰载体的形式存在，其特征在于，制备步骤如下:
[0008](I)在SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列两端加入BamH I和Hind III酶切位点，得到干扰片段；
[0009](2)将步骤(1)获得的干扰片段连接到经过BamH I和Hind III线性化的质粒载体上，获得干扰载体。
[0010]上述方法的具体步骤为:
[0011](I)在SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列两端加入BamH I和Hind III酶切位点，得到shRNA干扰片段；
[0012](2)将步骤(1)获得的干扰片段连接到经过BamH I和HindIII线性化的p-Genesil
1.0质粒载体上,获得p-Genesil-shIRSl干扰载体。
[0013]本发明还提供了一种制备shRNA干扰载体的方法，步骤如下:
[0014](I)分别在SEQ ID N0.1和SE Q ID N0.2所示的核苷酸序列两端加入BamH I和Hind III酶切位点，获得干扰片段；
[0015](2)分别将步骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamH I和Hind III线性化的质
粒载体上，获得重组质粒；
[0016](3)合成带有Nhe I和Xho I酶切位点的单链shIRS2干扰片段，连接到经过NheI和Xho I线性化的shIRSl载体，获得同时具有IRSl和IRS2基因的线性化载体；
[0017](4)扩增具有SnaB I与Nhe I酶切位点的hU6启动子，并将其连接到步骤(3)中获得的线性化载体，得到shRNA干扰载体。
[0018]上述方法的具体步骤如下:
[0019](I)分别在SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列两端加入BamH I和Hind III酶切位点，获得干扰片段；
[0020](2)分别将步骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamH I和Hind III线性化的p-Genesil 1.0 质粒载体上，获得重组质粒 p-Genesil-shlRSl 和 p-Genesil_shIRS2 ；
[0021](3)合成带有Nhe I和Xho I酶切位点的单链shIRS2干扰片段，连接到经过NheI和Xho I线性化的p-Genesil-shIRSl载体，获得同时具有IRSl和IRS2基因的线性化载体；
[0022](4)扩增具有SnaB I与Nhe I酶切位点的hU6启动子，并将其连接到步骤(3)中获得的线性化载体，得到p-Genesil-shlRSl/shIRS〗干扰载体。
[0023]本发明提供的shRNA干扰载体在抑制IRS基因表达中应用，特别是用于制备猪2型糖尿病模型的制品。
[0024]具体而言，根据已知的猪IRSl基因序列，设计4对引物，利用重叠PCR法，克隆猪的IRSl全长基因。对比人的IRS2基因序列和猪的基因组，根据保守区域序列设计引物，克隆猪ISR2的保守序列。
[0025]根据克隆获得猪IRSl以及IRS2序列，通过Ambion网站分别设计4对干扰片段，分别合成带有BamH I和Hind III酶切位点的单链shRNA干扰片段，复性成双链后，连接到经过BamH I和Hind III线性化的p-Genesil 1.0载体。构建成功并经筛选的有效干扰片段分别为shIRSl和shIRS2。重新合成带有Nhe I和Xho I酶切位点的单链shIRS2干扰片段，复性成双链后，连接到筛选出有效的经过Nhe I和Xho I线性化的p-Genesil-shIRSl载体。之后PCR扩增hU6启动子，带有SnaB I与Nhe I酶切位点，连入有两个基因干扰片段的线性化载体，经鉴定后，即获得p-Genesil-ShIRSl/ShIRS2干扰载体。
[0026]另外，本发明还检测了 p-Genesil_shIRSl/shIRS2干扰载体对猪源IRSl和IRS2基因表达的抑制效果和对猪肝脏细胞糖脂代谢的影响。
[0027]本发明还提供了一种p-Genesil-shlRSl/shIRS〗干扰载体用于制备抑制猪肝脏细胞IRSl和IRS2基因表达的模型猪制品。
[0028]本发明的优点在于，干扰载体p-Genesil-shIRSl/shIRS2具有非常明显地同时敲低猪源IRSl和IRS2基因表达的作用，对于构建2型糖尿病猪模型具有重要意义。因shRNA片段在体内一段时间会被降解，本发明研究成果对血糖浓度较低者采用RNA干扰技术提高血糖浓度具有借鉴意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1:猪IRSl基因电泳及结构图。
[0030]图2:猪IRSl基因的表达及有效片段的干扰效果。
[0031]图3:猪与人IRS2基因3’ UTR序列比对结果及有效干扰片段的筛选。
[0032]图4:p-Genesil-shIRSl/shIRS2 载体干扰 IRSl 和 IRS2 基因的表达。
[0033]图5:干扰IRSl和IRS2对糖代谢相关基因表达的影响。
[0034]图6:干扰IRSl和IRS2对胆固醇相关基因表达的影响。
【具体实施方式】
[0035]以下结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特别说明，均为购自常规生化试剂商店。
[0036]实验所用的巴马仔猪均来自东北农业大学实验基地猪场，实验所用的菌株质粒包括干扰载体 pGenesil 1.0 (Shen, Y.Μ., X.C.Yang, et al.(2010)." Growth inhibitioninduced by short hairpin RNA to silence survivin gene in human pancreatic cancercells." Hepatobiliary Pancreat Dis Int9 (I):69-77.)、猪胎儿原代成纤维细胞、大肠杆菌DH5a均来自东北农业大学胚胎工程实验室。反转录试剂盒、LA Taq酶、SYBR荧光实时定量PCR试剂盒、T4连接酶、PMD-18T载体、3’ RACE试剂盒、质粒大提试剂盒均购自Takara试剂公司；胶回收试剂盒购自Axygen公司；质粒小量试剂盒购自天根生物有限公司、DNA marker购自Trans gene公司；胎牛血清、DMEM培养基、非必需氨基酸、谷氨酰胺、Lipofectamin LTX and plus均购自Gibico公司；DNA测序由上海立菲生物技术有限公司完成。
[0037]SEQ ID N0.1:gcagtagtggcaagctcttgtgtgtgctgtccacaagagcttgccactactgc
[0038]SEQ ID N0.2:ggtttctggagatggagatgcgtgtgctgtccgcatctccatctccagaaacc
[0039]实施例1:
[0040]猪IRS基因的克隆及在各组织中的表达
[0041](1)猪IRSl基因的克隆[0042]根据已知得到的猪IRSl基因序列，设计4对引物(表1)，利用重叠PCR方法，克隆猪的IRSl全长基因。其中第1，2，4对引物为外显子区域，并且不跨内含子，直接以巴马猪的基因组为模板进行PCR扩增，第3对引物位于内含子区域，以巴马猪肝脏cDNA为模板进行PCR扩增，总体系为50ul。PCR反应体系包括:LA Taq lul, 10XLA Taq Buffer 5ul，dNTPs 4ul,模板 lul, Forward Primer 2ul, Reverse Primer 2ul,dH20 35ul。PCR 反应参数为:94°C预变性5min;94°C变性30s, 60°C退火30s, 72°C延伸2min, 35个循环；72°C终延伸lOmin。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中观察结果，将目的条带胶回收，连接PMD-18T克隆载体进行测序。
[0043]测序分别得到4段无突变序列之后，各自从质粒上PCR扩增下来，并进行胶回收，为了防止发生非特异性扩增，将胶回收片段进行末端补平，PCR总反应体系25ul，包括:Blunting Enzyme Mix lul, Quick Blunting Kit Buffer 2.5ul, dNTPs 2.5ul，胶回收片段10ul，dH20 9ul。PCR反应程序为:25°C lh，16°C 30min。得到了 4段目的片段，分别为IRS1-1，IRS1-2，IRS1-3，IRS1-4，作为重叠 PCR 的模板。首先将 IRSl-1 与 IRS1-2 重叠，PCR 总反应体系 50ul，反应体系包括:IRS1-1 lOul，IRS1-2 IOul,引物 4ul(IRSl_Fl 2ul，IRS1-R2 2ul), LA Taq lul, IOXLA Taq Buffer 5ul, dNTPs 4ul, dH20 16ul ;将 IRS1-3与IRS1-4重叠，PCR总反应体系50ul，反应体系包括:IRSl-3 10ul，IRS1-4 10ul，引物4ul (IRS1-F3 2ul, IRS1-R4 2ul)，LA Taq lul, IOXLA Taq Buffer 5ul, dNTPs 4ul, dH2016ul。PCR 反应程序为:94°C预变性 5min;94°C变性 30s，60°C退火 40s，72°C延伸 3min, 40个循环；72° C终延伸lOmin。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中观察结果，将目的条带胶回收，连接PMD-18T克隆载体进行测序，得到无突变的IRS1-12与IRS1-34片段，从质粒扩增下来之后，进行末端补平，补平实验体系如上，最终以IRS1-12与IRS1-34为模板，重叠PCR得到猪IRSl基因全长。PCR总反应体系为50ul，包括:IRS1-12 10ul，IRS1-34 lOul,引物 4ul (IRS1-F1 2ul, IRS1-R4 2ul)，LA Taq lul, IOXLA Taq Buffer 5ul, dNTPs 4ul,dH20 16ul。PCR反应程序为:94 °C预变性5min;94°C变性30s，62 °C退火40s，72 °C延伸3min30s, 40 个循环；72°C终延伸 IOmin。
[0044]结果显示，通过重叠PCR的方法，分4段扩增猪IRSl基因得到IRSl的全长基因。经过测序分析，克隆的IRSl基因与已知序列的氨基酸序列相似性为100%。猪IRSl基因mRNA全长为4814bp,由两个外显子组成,第一外显子为3747bp,第二外显子为1068bp,⑶S区序列为3726bp，3，-UTR序列为215bp(图1)，其中图1A为PCR扩增得到IRSl基因的四段片段，大小分别为1-2113bp，2-1612bp, 3_593bp，4_1106bp，图1B为重叠PCR得到猪IRSl基因全长，大小为4814bp，图1C为猪IRSl基因结构图。
[0045](2) IRSl基因在猪各组织器官中的表达
[0046]Real-time PCR方法检测巴马猪的15种组织器官中IRSl基因的表达。用Trizol试剂提取2d巴马猪的甲状腺、肺、肌肉、胎盘、肾上腺、胸腺、肝脏、气管、胰腺、垂体、大脑、海马体、舌、睾丸和十二指肠组织的RNA，并反转录为cDNA。Real-time PCR检测以上15种组织中IRSl基因的表达量。反应体系为20ul:Forward Primer 0.4ul, Reverse Primer
0.4ul，SYBR Mix 10ul，cDNA lul,dH20 7.8ul。反应程序为:95°C 30s ；95°C 5s,60°C 34s,40 个循环；95°C 15s,60°C lmin,95°C 15s。
[0047]结果表明，猪肝脏组织中IRSl的表达量显著高于其它组织(P〈0.01)(图2A)。接下来，我们在猪肝脏细胞中筛选IRSl基因的干扰片段。Nr5a2基因为肝脏细胞的特异表达基因，经Real-time PCR检测，Nr5a2基因在我们获得的猪肝脏细胞中高表达(图2B)。将p-Genesil-shIRSl-1-4转染猪肝脏细胞,对照组不转染干扰载体,Real-time PCR检测干扰效率。实验结果表明，shIRSl-Ι显著敲低了 IRSl基因的表达，干扰效率达到61%(图2C)。
[0048](3)猪IRS2基因3’UTR区域的克隆
[0049]人的IRS2基因序列为已知的，将人IRS2基因与猪的基因组进行比对，根据保守区域序列设计引物，以2d巴马猪肝脏组织cDNA为模板，克隆得到猪IRS2基因的保守序列，PCR 反应体系 20ul:cDNA 0.5ul，引物 2ul，rTaq 0.5ul, 10XPCR Buffer 2.5ul, dNTPs2ul, dH2017.5uL.PCR 反应程序为:94°C 5min ；94°C 30s, 59.3°C 30s, 72°C 30s，35 个循环；72°C IOmin0 PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中观察结果，将目的条带胶回收，连接PMD-18T克隆载体进行测序。得到无突变序列进行3’ RACE扩增，标准操作按照Takara公司试剂盒说明书进行。
[0050]结果显示，获得的片段为950bp，具有PolyA结构，位于猪11号染色体，不编码氨基酸，与人IRS2基因3’UTR序列的相似性达到了 73.08% (图3A)。将p-Genesil_shIRS2-l_4转染猪肝脏细胞，Real-time PCR检测干扰效率。实验结果表明，shIRS2_l显著敲低了 IRS2基因的表达，干扰效率达到60% (图3B)。
[0051]实施例2:
[0052]p-Genesil_shIRSl/shIRS2 干扰载体的构建
[0053]根据克隆获得猪IRSl以及IRS2序列，通过Ambion网站分别设计4对干扰片段(表2)，分别合成带有BamH I和Hind III酶切位点的单链shRNA干扰片段，复性成双链后，连接到经过BamH I和Hind III线性化的p-Genesil 1.0载体。经过测序正确之后，构建成功的载体为 p-Genesil-shIRSl-1-4 和 p-Genensil-shIRS2-l_4。
[0054]shIRSl-Ι和shIRS2_l分别为筛选出的有效干扰片段，重新合成带有Nhe I和XhoI酶切位点的单链shIRS2干扰片段，复性成双链后，连接到筛选出有效的经过Nhe I和
Xho I线性化的p-Genesil-shIRSl载体。之后PCR扩增hU6启动子，带有SnaB I与NheI酶切位点，连入有两个基因干扰片段的线性化载体，经过测序鉴定以后，序列正确的载体即为 p_Genesil_shIRSl/shIRS2 干扰载体。
[0055]实施例3:
[0056]猪肝原代细胞的培养及干扰载体效果的检测
[0057]( I)猪肝原代细胞的培养
[0058]取Id巴马猪肝脏组织约0.5cm3放置含有双抗的生理盐水中，对组织进行清洗，剥离肝脏表面系膜，剔除血液等杂物，清洗至肝脏组织呈鲜红色，洗液无明显杂物。将组织移置培养皿之后，用手术剪将其剪碎。添加Iml胶原酶放入37°C培养箱内进行消化5min。加入培养液进行终止。将组织吹散,将此混合物添加到离心管中进行离心，1200rpm，3min。离心后弃上清，加入3ml培养液重悬。接种到三个大皿中移置到37°C培养箱中培养。隔天观察细胞有组织块贴壁，换成新鲜的培养液。4-5天后在组织块周围有细胞长出待密度达到60%以上进行传代标记为Pl代，将Pl代培养至密度达到100%时，进行冻存。
[0059](2)干扰载体对猪干细胞糖脂代谢的影响
[0060]根据NCBI网站上提供的基因序列，设计猪PEPCK, G6Pase，F_l，6-BP，Gck,SREBP, Fasn, LXRA, Abcg8 和 Cyp7al 基因的 Real-time PCR 引物，每个基因设计 2 对引物，经过RT-PCR方法验证特异性后，通过Real-time PCR检测猪肝脏细胞在分别转染p-Genesi 1-shIRSI>p-Genesil-shIRS2 以及 p-Genesil-shlRSl/shIRS 干扰载体之后，上述基因表达量的变化情况。Real-time PCR反应体系为20ul:Forward Primer 0.4ul, ReversePrimer 0.4ul, SYBR Mix lOul, cDNA lul, dH20 7.8ul。反应程序为:95°C 30s ；95°C 5s,60°C 34s，40 个循环；95°C 15s，60°C lmin,95°C 15s。Real-time PCR 反应仪器的型号为ABI 7500。
[0061]将p-Genesil-shIRSl/shIRS2 转染猪肝脏细胞，Real-time PCR 验证 IRSl 基因的表达下降了 78%，IRS2基因的表达下降了 64%(图4)。采用Real-time PCR检测了糖代谢相关基因的表达变化。结果表明，磷酸烯醇丙酮酸激酶(PEPCK)，果糖-1，6-二磷酸酶(F-l, 6-BP)是糖异生作用的两种关键酶，不适当的激活这些酶表达会使糖异生作用增强，从而增加了血浆中葡萄糖含量。在同时干扰IRSl和IRS2基因时，猪肝脏细胞中PEPCK与F-l, 6-BP基因的表达分别为对照组的2.46倍与2.96倍。而单独干扰时，这两种基因的表达没有显著变化(图5A.B)。
[0062]葡糖激酶(Gck)是催化肝脏中糖酵解的第一步反应的关键酶，多存在于动物肝脏中。若基因表达被抑制，会影响糖酵解作用降低，血浆中葡萄糖含量会升高。本实验在猪肝脏细胞中单独敲低IRSl基因时，Gck表达下降了 79%，单独干扰IRS2基因之后，该基因表达无明显差异，但同时敲低IRSl和IRS2时，Gck基因表达下降了 36%(图5C)。
[0063]胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1)为胆固醇敏感器，可调节胆固醇代谢以及血浆中胆固醇水平。在同时敲低IRSl和IRS2基因的猪肝脏细胞中，检测胆固醇代谢关键基因的表达效果，结果表明=SREBP-1基因表达升高，可直接反映胆固醇水平升高。单独在猪肝脏细胞中敲低I RSl或IRS2时，该基因表达无明显变化，同时敲低这两个基因时，SREBP-1基因表达显著上升，为对照组3.0倍(图6A)。胰岛素还可以通过激活肝脏X受体(LXRA)来调节脂类代谢。只有当单独敲低IRS2基因时，LXRA基因的表达会显著上升，为对照组的
1.6倍(图6B)。LXRA下游与之相结合的一系列调节胆固醇代谢的基因，包括AbcgS以及CYP7al。实验结果表明，在单独敲低IRS2基因以及同时敲低IRSl和IRS2基因时，Abcg8基因的表达均显著上升，为对照组的4.6和4.8倍，CYP7al基因的表达也显著上升，为对照组的6.0和8.3倍(图6C)。以上结果表明，敲低IRSl和IRS2基因，会引起猪肝脏细胞胆固醇代谢的异常。
[0064]表1引物序列及扩增片段长度
[0065]
【权利要求】
1.一种抑制IRSl基因表达的shRNA，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述的shRNA用于制备抑制猪源IRSl基因的制品。
3.一种含有权利要求1所述的shRNA的干扰载体的制备方法，其特征在于，步骤如下: (1)在SEQID N0.1所示的核苷酸序列两端加入BamH I和Hind III酶切位点，得到干扰片段； (2)将步骤(1)获得的干扰片段连接到经过BamHI和Hind III线性化的质粒载体上，获得干扰载体。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)在SEQID N0.1所示的核苷酸序列两端加入BamH I和Hind III酶切位点，得到shRNA干扰片段； (2)将步 骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamHI和Hind III线性化的p-Genesil1.0质粒载体上,获得干扰载体p-Genesil-shIRSl。
5.一种含有权利要求1所述的shRNA的干扰载体的制备方法，其特征在于，步骤如下: (1)分别在SEQID N0.1和SE Q ID N0.2所示的核苷酸序列两端加入BamH I和Hind III酶切位点，获得干扰片段； (2)分别将步骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamHI和Hind III线性化的质粒载体上，获得重组质粒； (3)合成带有NheI和Xho I酶切位点的单链shIRS2干扰片段，连接到经过Nhe I和Xho I线性化的shIRSl载体，获得同时具有IRSl和IRS2基因的线性化载体； (4)扩增具有SnaBI与Nhe I酶切位点的hU6启动子，并将其连接到步骤(3)中获得的线性化载体，得到shRNA干扰载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)分别在SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列两端加入BamH I和HindIII酶切位点，获得干扰片段； (2)分别将步骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamHI和Hind III线性化的p-Genesil 1.0 质粒载体上，获得重组质粒 p-Genesil-shlRSl 和 p-Genesil_shIRS2 ； (3)合成带有NheI和Xho I酶切位点的单链shIRS2干扰片段，连接到经过Nhe I和Xho I线性化的p-Genesil-shIRSl载体，获得同时具有IRSl和IRS2基因的线性化载体； (4)扩增具有SnaBI与Nhe I酶切位点的hU6启动子，并将其连接到步骤(3)中获得的线性化载体，得到p-Genesil-shIRSl/shIRS2干扰载体。
7.权利要求3制备的shRNA干扰载体用于制备猪2型糖尿病模型的制品。
【文档编号】C12N15/85GK103589730SQ201310562508
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】孔庆然, 黄天晴, 刘忠华 申请人:东北农业大学