一种植物乳杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种植物乳杆菌及其应用，具体涉及一种新的植物乳杆菌LP45（YMC1005），CGMCC?NO.8072；还涉及植物乳杆菌LP45在降低胆固醇、提高免疫力，抑制肠道有害菌方面的应用。
【专利说明】一种植物乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种乳杆菌属的新菌株，更准确地说，本发明描述了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的一个新菌株LP45,属于生物【技术领域】。
【背景技术】[0002]益生菌对人类的健康有很大帮助，科学家们已对其进行了几十年的研究，现已证明在肠胃调节、抗氧化、降胆固醇、预防胃肠道癌症、免疫调节等方面均起到很好的作用。但是，益生菌的菌株种属范围非常广，即便同一种属的不同菌株之间个体差异都非常大，所以筛选工作非常困难，现在益生菌的应用中普遍存在摄入人体后生存率不高，对胃肠的吸附能力不强，在增强人体免疫力和抑制致病菌能力方面的表现不理想。因此，是否研究筛选到益生功能最优越的菌株作为益生菌应用就成为了如今益生菌研究的关键所在。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种商业编号为LP45,保藏编号为YMC1005的植物乳杆菌，它具备在人体胃肠中具有很高的生存率、较强的胃肠粘附力，提高人体免疫力的功能，能显著抑制胃、肠道致病菌，具备降低胆固醇的潜力，另一方面提供上述新菌株的用途。
[0004]为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为:
一种植物乳杆菌LP45，该植物乳杆菌已经于2013年8月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为:CGMCC N0.8072。
[0005]植物乳杆菌LP45具有胃肠道吸附能力。
[0006]植物乳杆菌LP45具有抑制胃肠道致病菌的功能。
[0007]植物乳杆菌LP45具有降低胆固醇的功能。
[0008]植物乳杆菌LP45具有提高免疫力的功能。
[0009]植物乳杆菌LP45用于制备抑制胃肠道致病菌的药品或食品。
[0010]植物乳杆菌LP45用于制备降低动物或人类体内胆固醇浓度的药品或食品。
[0011]植物乳杆菌LP45用于制备提高免疫力的药品或食品。
[0012]上述食品主要包括普通食品、减肥食品、保健食品。
[0013]在发明所提供的体外试验证实，植物乳杆菌LP45 (YMC1005或L45)具备良好的耐酸性及耐胆盐性，在胃肠道中生存率较高，并具备较强的胃肠道吸附能力，具备提高免疫力的功能，可有效抑制有害菌的繁殖，本发明所提供的菌株可显著降低胆固醇含量，在对心血管疾病的预防或治疗中具备较大潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明植物乳杆菌LP45 (YMC1005或L45)的基因指纹图谱。
[0015]在图1中:Μ为Maker、1为植物乳杆菌LP45 (YMC1005或L45)、2为植物乳杆菌ATCC14917。[0016]菌种保存
本发明菌种命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) LP45,于2013年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为:CGMCCN0.8072。保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【具体实施方式】
[0017]下面将结合附图和实施例对本发明进行进一步详细的说明。
[0018]实施例1菌株的筛选和保藏
本发明的植物乳杆菌LP45 (YMC1005或L45)是自内蒙古乌兰察布市四子王旗乌兰哈达苏木站乌兰哈达嘎查的传统酸奶酪中分离筛选获得，具体分离鉴定步骤如下:
将内蒙古四子王旗酸奶酪样品溶解于灭菌生理盐水试管中，充分震荡混匀，混匀后使用接菌环蘸取混合液体并于MRS平板上划线培养(37°C 72h)，分离菌株。用接菌环从第一代平板挑取单菌落，在新MRS平板上划线培养(37°C 72h)，进行纯化。同样方法再纯化2次，使最终平板上为同一形态菌落为止。挑取单菌落接菌于MRS液体培养基中37°C培养18h，以备保藏和鉴定使用。
[0019]将液体培养基菌悬液收集至灭菌离心管中，清洗离心2次，进行基因组DNA的提取，提取完毕后，利用通用引物27f:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1495r:5_’ CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ 进行 16S rDNA 的 PCR 实验，完成 PCR 后将最终 PCR 产物进行测序，并将测序结果与Gene Bank中相关序列进行比较，比较结果显示LP45 (YMC1005或L45)属于植物乳杆菌。
[0020]将LP45 (YMC1005或L45)及ATCC14917 (植物乳杆菌)菌株的纯培养液进行清洗离心，将获得的菌体进行基因组DNA的提取，提取完毕后，利用随机引物5’ -GACGGATCAG-3’进行RAPD实验，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并进行凝胶成像，对比两株植物乳杆菌的电泳条带，结果显示，植物乳杆菌LP45 (YMC1005或L45)与植物乳杆菌ATCC14917属于同一种属的不同菌株，结果见附图1。将植物乳杆菌LP45 (YMC1005或L45)于2013年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为:CGMCCN0.8072。
[0021]实施例2胃肠道生存率试验
采用人工消化液实验(胃酸抵抗性以及胆汁酸抵抗性)来研究植物乳杆菌LP45(YMC1005)在人的肠道环境下的生存性。
[0022]1、耐酸性试验
植物乳杆菌LP45 (YMC1005或L45)由冻存管活化，经3次活化(第一次活化24h，第二次活化14h，第三次活化18h)后3%接种于4支pH3.0 (使用盐酸调pH)的液体MRS培养基试管，每支试管装有10ml的液体MRS培养基。取1支pH3.0的液体MRS培养基试管3%接种后用于测Oh的活菌数；另三支pH3.0的液体MRS培养基试管3%接种后用于测4h的0D600，取其中两支测活菌数。
[0023]存活率=4h活菌数/Oh活菌数*100%
2、耐胆盐试验
植物乳杆菌LP45 (YMC1005或L45)由冻存管活化，经3次活化(第一次活化24h，第二次活化14h，第三次活化18h)后3%接种于4支0.3%胆盐(sigma胆盐)的液体MRS培养基试管，每支试管装有10ml的液体MRS培养基。取1支0.3%胆盐的液体MRS培养基试管3%接种后用于测Oh的活菌数;另三支0.3%胆盐的液体MRS培养基试管3%接种后用于测4h的0D600，取其中两支测活菌数。
[0024]存活率=4h活菌数/Oh活菌数*100%
结果和结论:经试验得到LP45(YMC1005或L45)在pH3.0的液体培养基中，4小时后的存活率达到了 122.4%，高于竞品鼠李糖乳杆菌11^ (98.9%)及嗜酸乳杆菌从^11 (51.2%)；在0.3%胆汁酸的液体培养基中，4小时后生存率达到了 47.8%。高于竞品菌株LGG (1.3%)及 NCFM (2.1%)。
[0025]众所周知，益生菌在被摄取后需经受消化液的考验才能到达肠道，本实验结果证明了 LP45 (YMC1005或L45)具备较高的胃肠道生存率，也显示了菌株作为益生菌开发的潜力。[0026]实施例3胃肠道吸附能力试验
采用LP45 (YMC1005或L45)菌株吸附Caco_2细胞来研究LP45 (YMC1005或L45)菌株对胃肠道上皮细胞的吸附能力，发现LP45 (YMC1005或L45)粘附力为72。
[0027]具体的操作步骤为:
1、将人体肠道细胞株Caco-2以1ml 0.05%胰岛素处理5min后，将细胞轻轻拍下，分装于96孔的培养盘中，每个孔洞中加入lOOOOcells，每天换200 μ 1新鲜的DiffiM培养基。
[0028]2、植物乳酸杆菌LP45 (YMC1005或L45)分别以MRS活化两次后，接种至5mlMRSbroth进行培养，于24小时后取lml以6000rpm离心10分钟后，以PBS (pH 7.2)清洗两次得到乳酸菌菌液。加入20 μ 1乳酸菌菌液于步骤1的细胞中，接着培养1小时使乳酸菌附着，
3、乳酸菌附着1小时后，倒除培养基，以PBS缓冲液洗5次以去除未附着的乳酸菌，加入100μ 1，10%福尔马林，30分钟，固定细胞及细菌，再以PBS缓冲液洗3次，最后以100 μ 1结晶紫进行染色，五分钟后以少量75%酒精快速冲洗，去除细胞上的染色剂。
[0029]4、利用相位差显微镜观察乳酸菌对肠道上皮细胞的吸附性，随机在不同的显微镜视野下，观察并计算50个细胞的乳酸菌吸附情形，最后计算每个细胞平均吸附的乳酸菌数量。
[0030]经试验结果可知，本发明植物乳杆菌LP45 (YMC1005或L45)的粘附力72，粘附力较强。筛选益生菌的一个重要指标就是其对胃肠道上皮细胞和粘膜的粘附力。粘附力强的益生菌在肠粘膜的定殖时间也相应有所延长，这对于发挥益生菌的免疫调节作用和刺激修复肠道损伤部位具有重要意义。
[0031]实施例4免疫力试验
采用 Caco-2 细胞，10%FBS 的 RPM1640 培养基在 37°C，5%C02 条件下与 LP45 (YMC1005或L45)菌株共培养，发现LP45 (YMC1005或L45)菌株无论是活菌还是加热失活后都能够显著调节Caco-2细胞中IL-6和IL-8的表达。
[0032]采用小鼠巨噬细胞(J774.1)，10%FBS的RPM1640培养基在37°C，5%C02条件下与LP45 (YMC1005或L45)菌株共培养，发现LP45 (YMC1005或L45)菌株明显促进了 IL-6的分泌，使IL-6表达量由0提高到了 110ng/ml。[0033]由试验结果可见，植物乳杆菌LP45 (YMC1005或L45)具备增强免疫力的功能。
[0034]实施例5胆固醇含量测定试验
1、绘制标准曲线
精确量取胆固醇标准液 0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4ml、1.6ml
置于干燥试管中，并用无水乙醇定容至2.0ml，再沿壁缓慢加入2.0ml硫酸铁铵显色液，震荡混匀，待冷却至室温，与紫外分光光度计560nm处测定吸光度。以胆固醇浓度为横坐标，0D560为纵坐标，绘制标准曲线。
[0035]2、胆固醇测定
a.物乳酸杆菌LP45 (YMC1005)在MRS液体培养基中活化3代，按麦氏比浊法调菌浓度为3.0 X 109CFU/ml按2%的接种量接种到含胆固醇的MRS液体培养基中37 °C培养，分别培养 24 h、48h。
[0036]b.取培养液0.2 mL置于干燥离心管中，先加0.8 mL无水乙醇，摇匀后，再加4 mL无水乙醇(无水乙醇分2次加入，目的使蛋白质以分散很细的沉淀析出)，加盖，快速混匀器混匀，离心(10000 r/min, 15 min)。
[0037]c.用微量移液器准确移取上清液2 mL加入到比色管内，再加入2 mL硫酸铁铵显色液，加入时要沿管壁缓慢加入，使两液间保持明显界面，加完后充分振摇混匀(不能边加边摇)，以便产生高热(大于80 °C)促进显色。
[0038]d.将各管放置15 min，待管内反应液冷却至室温，在30~60 min内在分光光度计上于560 nm处测定吸光度。以2 mL无水乙醇加2 mL硫酸铁试剂为空白管，以未接菌的含胆固醇的MRS液体培养A0560为标准值。
[0039]e.胆固醇降解率=(A0560- A560) / A0560X100%。
[0040]结果和结论:经试验，LP45 (YMC1005或L45)胆固醇降解率为80.2%，略低于竞品菌株NCFM (89.6%)，高于菌株1^6 (34.7%)，说明其具有很强的胆固醇脱除能力。
[0041]实施例6抑菌试验
包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌实验。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌使用LB液体培养基活化18h后，稀释到105-106cfu/ml取200ul均匀涂抹到LB固体培养基培养皿中，半小时后摆放牛津杯，每个培养皿摆放3个,分别标为A、B、C, A代表培养液原液、B代表调pH5.5后的培养液原液、C代表调pH5.5后的培养液原液稀释10倍。每个牛津杯加入300ul，37°C培养24h后测量抑菌圈。
[0042]经检测，该菌株大肠杆菌抑菌圈为11.98_，对金黄色葡萄球菌抑菌圈为24.8_。结果显示LP45 (YMC1005或L45)对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用。
[0043]以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
【权利要求】
1.一种植物乳杆菌LP45，该植物乳杆菌已经于2013年8月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为:CGMCC N0.8072。
2.根据权利要求1所述的一种菌植物乳杆菌LP45，其具有胃肠道吸附能力。
3.根据权利要求1所述的一种菌植物乳杆菌LP45，其具有抑制胃肠道致病菌的功能。
4.根据权利要求1所述的一种菌植物乳杆菌LP45，其具有降低胆固醇的功能。
5.根据权利要求1所述的一种菌植物乳杆菌LP45，其具有提高免疫力的功能。
6.—种如权利要求1-5任一项所述的植物乳杆菌LP45的应用，其特征在于:用于制备抑制胃肠道致病菌的药品或食品。
7.—种如权利要求1-5任一项所述的植物乳杆菌LP45的应用，其特征在于:用于制备降低动物或人类体内胆固醇浓度的药品或食品。
8.—种如权利要求1-5任一项所述的植物乳杆菌LP45的应用，其特征在于:用于制备提闻免疫力的药品 或食品。
【文档编号】C12R1/25GK103642716SQ201310587738
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】赵林森, 龄南, 葛春美, 马新颖, 齐世华 申请人:河北一然生物科技有限公司