生产丙酮酸的菌株及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种生产丙酮酸的菌株及其构建方法，其构建方法如下：将D-氨基酸氧化酶基因DAAO通过EcoRI或BamHI克隆在pUC57质粒中获得质粒pUC57-DAAO，以质粒pUC57-DAAO为模板进行基因扩增，将基因DAAO扩增获得的产物克隆至质粒pET28a或pET21a中，选取培养得到质粒中连接上含有DAAO的DNA片段的阳性克隆质粒，将上述构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中，选取培养得到能够将D-丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株；D-氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点。上述构建得到的菌株能够直接通过生物转换法将D-丙氨酸转化为丙酮酸。
【专利说明】生产丙酮酸的菌株及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种丙酮酸的生产领域，具体而言，本发明提供了一种用于从生产丙酮酸的菌株及该菌株的构建方法。
【背景技术】
[0002]丙酮酸是一种α-酮酸，在生物化学代谢途径中扮演重要的角色。作为一种重要的有机酸，丙酮酸不仅是人体三羧酸循环和氨基酸合成过程中重要的中间体，同时在食品、化工和制药工业及科学研究中有着广泛的用途。在制造工业中，常被用作食品添加剂、重量控制添加剂、保健食品和抗氧化剂等。同时，因为丙酮酸既具有活性的酮基又具有活性羧基基团，因此常被作为一种重要的原材料广泛的用于化工、制药和农业化学品生产中，如其可以作为合成L-酪氨酸、N-乙酰-D-甘露糖胺丙酮酸及(R)-苯乙酰甲醇等制药前体的原料。
[0003]目前丙酮酸的生产方法主要有化学法和生物法。其中，化学法生产丙酮酸在工业上主要是通过使酒石酸脱水和去羰基来合成。这种生产丙酮酸的方法操作简单，但是污染重、成本高。生物法生产丙酮酸主要包括直接发酵、酶催化法和全细胞转化法。发酵生产丙酮酸的菌株包括多种维生素缺陷型的酵母Torulopsis glabrata、硫辛酸缺陷性的大肠杆菌和酵母菌株。目前酵母菌发酵生产的丙酮酸产量最高，可达135g/L，转化率达0.54g/g。另外，重组大肠杆菌YYC202发酵生产丙酮酸的最高产量为110g/L，转化率为0.87g/g。 [0004]发酵法生产丙酮酸有很多缺陷。由糖发酵生产丙酮酸的产率一直较低。另外，从发酵液中分离丙酮酸是一个复杂而且昂贵的过程。生物催化法作为一种替代方法应运而生。生物催化法生产丙酮酸可以通过全细胞催化或者酶催化完成。其中，全细胞催化生产丙酮酸是通过生物催化底物直接进行转化，不需要复杂的生长培养基，减少了下游分离纯化的成本。例如，在优化条件下，使用Pseudomonas sp.g31菌株进行生物转化,能够在24h内将IOOmM的富马酸转化为94mM的丙酮酸。另外，使用大肠杆菌YYC202进行全细胞转化由葡萄糖生产丙酮酸，最高转化率为0.93g/g，这是发酵生产无法达到的。
[0005]实现工业化生物转化法生产丙酮酸的关键是使用价格低于丙酮酸的原材料通过高效的转化方法进行生产。目前，可用于生物催化法生产丙酮酸的底物主要包括D-丙氨酸、1，2_丙二醇，延胡索酸以及乳酸等。目前，已经有多种涉及的关键酶基因被克隆并进行了研究，但是使用这些酶进行生物转化的条件还未优化。
[0006]为了实现全细胞催化法生产丙酮酸，需要选择从较低成本的原材料出发，通过设计高效的生物催化途径实现丙酮酸生产，并通过对反应途径中关键酶蛋白活性进行优化以及对生物转化条件的优化来获得高效生物催化生产丙酮酸的方法。
【发明内容】
[0007]本发明的首要目的是提供一种生产丙酮酸的菌株及其构建方法，其可有效的用于生物转换法生产丙酮酸。
[0008]一种生产丙酮酸菌株的构建方法，其构建方法如下:[0009]将D-氨基酸氧化酶基因DAAO通过EcoRI或BamHI克隆在pUC57质粒中获得质粒PUC57-DAA0,以质粒pUC57_DAA0为模板进行基因扩增，将基因DAAO扩增获得的产物克隆至质粒pET28a或pET21a中，选取培养得到质粒中连接上含有DAAO的DNA片段的阳性克隆质粒，将上述构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21 (DE3)中，选取培养得到能够将D-丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株；
[0010]D-氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点。
[0011]上述构建得到的菌株能够直接通过生物转换法将D-丙氨酸转化为丙酮酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为质粒pET28a_RgDAA0的示意图；
[0013]图2 为质粒 pACYCDuet-1-katE-alaR 的不意图。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例是对本发明的进一步的说明，并不构成对本发明实质内容的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。
[0015]操作ID-氨基酸氧化酶基因的合成与克隆
[0016]D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase, DAA0)的合成与克隆,分为以下几个操作:
[0017]步骤1:D_氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase, DAAO)的全基因合成:
[0018]通过全基因合成法，分别合成来自Cyprinus carpio、Rhodotorula gracilis和Trigonopsis variabilis的D-氨基酸氧化酶基因。基因合成由金唯智生物科技(北京)有限公司完成。合成的基因通过EcoRV克隆在pUC57质粒中。三个基因分别命名为CcDAAO、RgDAAO和 TvDAAO。
[0019]合成的三个基因的序列分别为:
[0020]CcDAAO:A273T255C254G262|GC%:49.43%|Length:1044
[0021]ATGAGGGTGTGCATCATTGGAGCGGGGGTCATCGGCCACTCCACTGCTCAGAGCATCTACCAGCACTTCCACGACAGGATCGCCCCTCTCACCATAGAGGTGTATGCTGATGTCTTCACTCCACTCACCACCAGCGACGGGGCAGCTGGACTCTGGCAGCCGTATCTCTATGACAAGGGGAATGTGCAAGAAACTAAATGGAACAAAGAGACGTTTCAGTATCTACTAAGTTGCCTCAGCTCTCCAGATTCTGTGAGAATGGGAATCTTCCTCCAGTCTGGCTATAATCTGTGCACTGAACCCCTGCCGGACCCCTCATTTAAAGACACTGTGTTGGGCTTTCGCAAGCTGACTCAACGTGAACTAGACATGTTCCCAGGATACAGTTTTGGGTGGTTCAACACTGCTCTCATGGTTGAAGGAAAAACATACCTGCCCTGGCTTATGGACTGGCTAAGACAAAGAAAGGTCAAGTTTTATCAGAGGAAGATTGGTTCATTTAAAGAGCTGGCAGACATCGGTGCTGATGTTATCATCAACTGCTCTGGTGTACGATCAGGAGACCTTCAGCCTGATCCTGAGCTCCAGCCAGGCAGAGGACAGATCATTAAGGTAGACGCTCCCTGGTTAAAACACTGGATCCTTACACATGATTCCTCATCAGGAGTTTATAACTCACCGTACATCATTCCTGGGAGTCGTTTAGTCACTGTGGGTGGAGTTTTCCAAATAGGAAACTGGAATCTGCAGAACAGTTCTGTGGACCATAAAGGAATCTGGGAAGCTGCCTGCAAGCTTGATCCCAGTCTACAGCATGCGCGGATAGTAGAGGACTGGACTGGTCTCAGGCCTGCACGCAGCAAAGTTAGACTGGAGAGAGAGACCATACGATCTGGACCAACCTCATTTGAGGTCATTCATAACTACGGACATGGAGGTTTTGGACTGACCATCCATCGTGGATGTGCTGAGGAAGCTGCTCGTCTCTTTGGT
CAGATCCTGGAGCAGAAAGGCCTGCTAGCACACTCTAAATCACGTCTCTAA
[0022]RgDAA0:A221T194C345G347|GC%:62.51%|Length:1107
[0023]ATGCACTCGCAGAAGCGCGTCGTTGTCCTCGGATCAGGCGTTATCGGTCTGAGCAGCGCCCTCATCCTCGCTCGGAAGGGCTACAGCGTGCATATTCTCGCGCGCGACTTGCCGGAGGACGTCTCGAGCCAGACTTTCGCTTCACCATGGGCTGGCGCGAATTGGACGCCTTTCATGACGCTTACAGACGGTCCTCGACAAGCAAAATGGGAAGAATCGACTTTCAAGAAGTGGGTCGAGTTGGTCCCGACGGGCCATGCCATGTGGCTCAAGGGGACGAGGCGGTTCGCGCAGAACGAAGACGGCTTGCTCGGGCACTGGTACAAGGACATCACGCCAAATTACCGCCCCCTCCCATCTTCCGAATGTCCACCTGGCGCTATCGGCGTAACCTACGACACCCTCTCCGTCCACGCACCAAAGTACTGCCAGTACCTTGCAAGAGAGCTGCAGAAGCTCGGCGCGACGTTTGAGAGACGGACCGTTACGTCGCTTGAGCAGGCGTTCGACGGTGCGGATTTGGTGGTCAACGCTACGGGACTTGGCGCCAAGTCGATTGCGGGCATCGACGACCAAGCCGCCGAGCCAATCCGCGGGCAAACCGTCCTCGTCAAGTCCCCATGCAAGCGATGCACGATGGACTCGTCCGACCCCGCTTCTCCCGCCTACATCATTCCCCGACCAGGTGGCGAAGTCATCTGCGGCGGGACGTACGGCGTGGGAGACTGGGACTTGTCTGTCAACCCAGAGACGGTCCAGCGGATCCTCAAGCACTGCTTGCGCCTCGACCCGACCATCTCGAGCGACGGAACGATCGAAGGCATCGAGGTCCTCCGCCACAACGTCGGCTTGCGACCTGCACGACGAGGCGGACCCCGCGTTGAGGCAGAACGGATCGTCCTGCCTCTCGACCGGACAAAGTCGCCCCTCTCGCTCGGCAGGGGCAGCGCACGAGCGGCGAAGGAGAAGGAGGTCACGCTTGTGCATGCGTATGGCTTCTCGAGTGCGGGATACCAGCAGAGTTGGGGCGCGGCGGAGGATGTCGCGCAGCTCGTCGACGAGGCGTTCCAGCGGTACCACGGCGCGGCGCGGGAGTCGAAGTTGTAG
[0024]TvDAA0:A241T292C286G252|GC%:50.23%|Length:1071
[0025]ATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTGCCGGTGTTGCCGGTTTAACTACAGCTCTTCAACTTCTTCGTAAAGGACATGAGGTTACAATTGTGTCCGAGTTTACGCCCGGTGATCTTAGTATCGGATATACCTCGCCTTGGGCAGGTGCCAACTGGCTCACATTTTACGATGGAGGCAAGTTAGCCG`ACTACGATGCCGTCTCTTATCCTATCTTGCGAGAGCTGGCTCGAAGCAGCCCCGAGGCTGGAATTCGACTCATCAACCAACGCTCCCATGTTCTCAAGCGTGATCTTCCTAAACTGGAAGGTGCCATGTCGGCCATCTGTCAACGCAACCCCTGGTTCAAAAACACAGTCGATTCTTTCGAGATTATCGAGGACAGGTCCAGGATTGTCCACGATGATGTGGCTTATCTAGTCGAATTTGCTTCCGTTTGTATCCACACCGGAGTCTACTTGAACTGGCTGATGTCCCAATGCTTATCGCTCGGCGCCACGGTGGTTAAACGTCGAGTGAACCATATCAAGGATGCCAATTTACTACACTCCTCAGGATCACGCCCCGACGTGATTGTCAACTGTAGTGGTCTCTTTGCCCGGTTCTTGGGAGGCGTCGAGGACAAGAAGATGTACCCTATTCGAGGACAAGTCGTCCTTGTTCGAAACTCTCTTCCTTTTATGGCCTCCTTTTCCAGCACTCCTGAAAAAGAAAATGAAGACGAAGCTCTATATATCATGACCCGATTCGATGGTACTTCTATCATTGGCGGTTGTTTCCAACCCAACAACTGGTCATCCGAACCCGATCCTTCTCTCACCCATCGAATCCTGTCTAGAGCCCTCGACCGATTCCCGGAACTGACCAAAGATGGCCCTCTTGACATTGTGCGCGAATGCGTTGGCCACCGTCCTGGTAGAGAGGGCGGTCCCCGAGTAGAATTAGAGAAGATCCCCGGCGTTGGCTTTGTTGTCCATAACTATGGTGCCGCCGGTGCTGGTTACCAGTCCTCTTACGGCATGGCTGATGAAGCTATTTCTTACGTCGAAAGAGCTCTTACTCGTCCAAACCTTTAG
[0026]步骤2:D_ 氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase, DAAO)的克隆
[0027]用于D-氨基酸氧化酶克隆与表达的质粒见表1，以pET28a_RgDAA0质粒的构建为例，如图1所示，详细描述D-氨基酸氧化酶基因的表达质粒的构建过程。
[0028]以全基因合成获得的质粒pUC57_RgDAA0为模板，使用引物RgDAAO-up-Ndel/RgDAAO-down-EcoRI,扩增获得来自Rhodotorula gracilis菌株的D-氛基酸氧化酶基因RgDAAO，基因片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点。
[0029]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP 各IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5μ 1，总体积为 50μ I。
[0030]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸30秒(30个循环);72°C延伸10分钟(I个循环)。
[0031]克隆操作为:
[0032]将以引物RgDAAO-up-NdeI/RgDAAO-down-EcoRI 扩增获得的 RgDAAO 基因的 PCR片段进行清洗纯化，获得含有RgDAAO基因的DNA片段(1124bp)。酶切体系为=OJyg的RgDAAO DNA 片段，2 μ 110*CutSmart Buffer (NewEngland Biolabs Phusion 公司)，I μ INdeKNewEngland Biolabs Phusion 公司)，I μ I EcoR1-HFCNewEngland Biolabs Phusion公司)，补充蒸馏水至20μ1，37?温浴10分钟。然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有RgDAAO 的 DNA 片段。质粒 pET28a 的酶切体系:I μ g 的质粒 pET28a，2 μ 110*CutSmartBuffer (NewEngland Biolabs Phusion 公司)，I μ I NdeI (NewEngland Biolabs Phusion公司)，1 μ IEcoR1-HFCNewEngland Biolabs Phusion 公司),补充蒸懼水至 20 μ 1,37°C温浴10分钟。然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pET28a的DNA片段。连接体系:10ng酶切回收的 pET28a 片段,20ng RgDAAO 的 DNA片段，2 μ I Quick Ligation Reaction Buffer,加蒸馏水补充至10μ 1，然后加0.5μ I Quick T4DNA Ligase，25°C放置10分钟，取5 μ I加入50 μ I Transl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μ1 LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为50ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将RgDAAO DNA片段克隆到pET28a中的质粒)进行测序验证，测序结果在酶切后的pET28a质粒中连接上`了含有RgDAAO的DNA片段，证明质粒构建正确，质粒命名为pET28a-RgDAA0。
[0033]CcDAAO基因克隆所需质粒pET28a_CcDAA0的构建与转化同以上提到的pET28a-RgDAA0的构建与转化，所构建质粒见表1，所用引物见表2 ；
[0034]TvDAAO基因克隆所需质粒pET28a_CcDAA0的构建与转化同以上提到的pET28a-RgDAA0的构建与转化，只是用核酸内切酶BamHI替代所述中用的EcoRI，所构建质粒见表1，所用引物见表2;
[0035]RgDAAO基因克隆所需质粒pET2 Ia-RgDAAO的构建与转化同以上提到的pET28a-RgDAA0的构建与转化，只是用质粒pET21a替代所用的pET28a，用氨苄青霉素替代所用的卡那霉素，所构建质粒见表1，所用引物见表2 ;
[0036]CcDAAO基因克隆所需质粒pET2Ia-CcDAAO的构建与转化同以上提到的pET28a-RgDAA0的构建与转化，只是用质粒pET21a替代所用的pET28a，用氨苄青霉素替代所用的卡那霉素，所构建质粒见表1，所用引物见表2 ；
[0037]TvDAAO基因克隆所需质粒pET2Ia-CcDAAO的构建与转化同以上提到的pET28a-RgDAA0的构建与转化，只是用质粒pET2Ia替代所用的pET28a，用核酸内切酶BamHI替代所述中用的EcoRI，用氨苄青霉素替代所用的卡那霉素，所构建质粒见表1，所用引物见表2 ;[0038]表1本发明中用于丙酮酸生物催化中所使用的质粒
[0039]
【权利要求】
1.一种生产丙酮酸菌株的构建方法，其构建方法如下: 将D-氨基酸氧化酶基因DAAO通过EcoRI或BamHI克隆在pUC57质粒中获得质粒PUC57-DAA0,以质粒pUC57_DAA0为模板进行基因扩增，将基因DAAO扩增获得的产物克隆至质粒pET28a或pET21a中，选取培养得到质粒中连接上含有DAAO的DNA片段的阳性克隆质粒，将上述构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中，选取培养得到能够将D-丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株； D-氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点。
2.如权利要求1所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，还包括: 以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，基因扩增枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因alaR，将基因alaR扩增获得的产物克隆到质粒pACYCDuet_l的NdeI和XhoI酶切位点构建得到质粒 pACYQ)uet-l_alaR ； 以大肠杆菌的基因组DNA为模板，基因扩增大肠杆菌的过氧化氢酶基因katE，将基因katE扩增获得的产物克隆到质粒pACYCDuet-1-alaR的SacI和SalI酶切位点构建得到质粒 pACYCDuet-1-katE-alaR ； 将构建得到的质粒pACY⑶uet-1-katE-alaR电转化入第一菌株中，构建获得能够将L-丙氨酸转化为丙酮酸的第二菌株。
3.如权利要求2所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于:D-氨基酸氧化酶基因 DAAO 为 CcDAAO 或 RgDAAO 或 TvDAAO ;质粒 pUC57_DAA0 为质粒 pUC57_CcDAA0 或质粒pUC57-RgDAA0 或质粒 pU C57_TvDAA0，基因 CcDAAO、RgDAAO、TvDAAO 以及基因 alaR、katE 进行基因扩增和克隆所选用的引物分别如下:
4.如权利要求3所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，质粒pUC57-DAA0为模板进行DAAO基因扩增的具体操作为: 扩增体系为:NewEngland Biolabs Phusion5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP 各10πιΜ)1μ 1、DNA 模板 20ng、引`物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50μ I ； 扩增条件为:98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸30秒(30个循环);72°C延伸10分钟(I个循环); DAAO基因扩增产物克隆至pET28a或pET21a质粒中的具体操作为: 将基因DAAO扩增获得的DAAO基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有DAAO基因的DNA 片段(1124bp)； 酶切体系为:0.2μ g 的 DAAO DNA 片段，2μ 110*CutSmart Buffer, I μ I NdeI, I μ IEcoR1-HF，补充蒸馏水至20μ 1，37°C温浴10分钟，然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有DAAO的DNA片段； 质粒 pET28a 或 pET21a 的酶切体系:1μ g 的质粒 pET28a 或 pET21a，2 μ 110*CutSmartBuffer, I μ I NdeI, I μ I EcoR1-HF，补充蒸馏水至20μ 1，37°C温浴10分钟，然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pET28a的DNA片段； 连接体系:IOng酶切回收的pET28a片段，20ng RgDAAO的DNA片段，2 μ I QuickLigation Reaction Buffer,加蒸懼水补充至 10 μ I,然后加0.5 μ I Quick T4DNA Ligase,25°C放置10分钟，取5 μ I加入50 μ I Transl感受态细胞中，冰浴30分钟； 42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟；加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时；取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为50ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒。
5.如权利要求4所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，将构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中的具体操作为: 步骤1:将阳性克隆质粒接到4ml LB培养基中(含有终浓度为50 g/ml的卡那霉素)，在37度，250转/分钟条件下过夜培养，使用质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒存于-20度备用； 步骤2:取Iy I步骤I中提取的质粒，加入50 μ I BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30分钟，42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟，加入500 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时，取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为50ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，选取培养得到能够将D-丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株。
6.如权利要求3所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，基因扩增枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因alaR的具体操作为: 扩增体系为:NewEngland Biolabs Phusion5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP 各IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50μ I ； 扩增条件为:98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸30秒(30个循环);72°C延伸10分钟(I个循环); alaR基因扩增产 物克隆到pACY⑶uet-Ι质粒NdeI和XhoI酶切位点的具体操作条件为: 将alaR基因扩增获得的alaR基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有alaR基因的DNA 片段(1192bp)； 酶切体系为2μ g 的 alaR DNA 片段，2 μ 110*CutSmart Buffer, I μ I NdeI, I μ IXhoI，补充蒸馏水至20 μ 1，37°C温浴10分钟；然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有alaR的DNA片段； 质粒 pACYCDuet-1 的酶切体系:1 P g 的质粒 pACYCDuet-1, 2 μ 110*CutSmart Buffer,Iμ I NdeI, I μ I Xhol，补充蒸馏水至20 μ 1，37°C温浴10分钟；然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pACY⑶uet-Ι的DNA片段； 连接体系=IOng酶切回收的pACYCDuet-Ι片段，20ng alaR的DNA片段，2 μ I QuickLigation Reaction Buffer,加蒸懼水补充至 10 μ I,然后加0.5 μ I Quick T4DNA Ligase,25°C放置10分钟，取5μ I加入50 μ I Transl-Tl感受态细胞中，冰浴30分钟；42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μ1 LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时，取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为34 g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取将alaR DNA片段克隆到pACYCDuet-Ι中的质粒pACYCDuet-1-alaR。
7.如权利要求3所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，基因扩增大肠杆菌的过氧化氢酶基因katE的具体操作条件为: 扩增体系为:NewEngland Biolabs Phusion5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP 各IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50μ I ； 扩增条件为:98°c预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸1分钟(30个循环);72°C延伸10分钟(I个循环); katE基因扩增产物克隆到pACYCDuet-1-alaR质粒的SacI和SalI酶切位点的具体操作为: 将katE基因扩增获得的katE基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有katE基因的DNA 片段(1192bp)；
酶切体系为:0.2 μ g 的 katE DNA 片段，2 μ 110*CutSmart Buffer, I μ I Sac 1-HF, .1 μ ISall-HF，补充蒸馏水至20μ 1，37°C温浴10分钟，然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有katE的DNA片段； 质粒 pACYO)uet-1-alaR 的酶切体系:Iyg 的质粒 pACYO)uet-1-alaR,.2 μ 110*CutSmart Buffer, I μ I Sac1-HF，I μ I Sall-HF，补充蒸馏水至 20 μ 1，37°C温浴 10分钟；然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pACYCDuet-1-alaR的DNA片段； 连接体系:10ng酶切回收的pACYCDuet-1-alaR片段，20ng katE的DNA片段，2 μ IQuick Ligation Reaction Buffer,加蒸懼水补充至 10 μ I,然后加 0.5 μ I Quick T4DNALigase, 25°C放置10分钟，取5 μ I加入50 μ I Transl-Tl感受态细胞中，冰浴30分钟；.42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟；加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时；取20()11 I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为34g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取将katE DNA片段克隆到pACYCDuet-1-alaR中的质粒 pACYCDuet-1-katE-alaR。
8.如权利要求3所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，质粒pACYCDuet-1-katE-alaR电转化入第一菌株中的具体操作为: 步骤1:液体培养第一菌株至0D550=0.5，4度，5000转/分钟条件下离心收集细胞，弃上清液； 步骤2:用冰预冷的灭菌水20mL悬浮细胞，并在同样条件下离心，弃上清液； 步骤3:重新用IOmL冰预冷的灭菌水洗涤细胞，并在同样条件下离心，弃上清液； 步骤4:重复步骤3 一次，弃上清，并用100L灭菌水悬浮细胞； 步骤5:取50L步骤4中获得的细胞，加入I L质粒pACYCDuet-1-katE-alaR，冰上放置2分钟,转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯；使用MicroPulser电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv,电击 后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm,.37°C孵育I小时，取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素和氯霉素(终浓度分别为50g/ml和34g/ml)的LB平板上，37°C过夜培养，挑取能够将L-丙氨酸转化为丙酮酸的第二菌株。
【文档编号】C12N15/70GK103882045SQ201310653141
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】张学礼, 张冬竹 申请人:合肥百迈生物技术有限公司