胆固醇脱氢酶的基因优化及其高效表达的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种胆固醇脱氢酶的基因优化及其高效表达，属于利用重组DNA技术生产蛋白质领域。具体而言，本发明提出了优化的、适合大肠杆菌表达系统或毕赤酵母表达系统的胆固醇7,8-脱氢酶的DNA序列，以及有关工程菌的构建和胆固醇7,8-脱氢酶表达优化工艺的研究。本发明将优化后的基因转入到大肠杆菌及毕赤酵母中进行表达，相比于优化前，该优化基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达量有显著提高。
【专利说明】胆固醇脱氢酶的基因优化及其高效表达
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用重组DNA技术生产蛋白质领域。更具体的，本发明涉及基于大肠杆菌密码子偏爱设计优化的重组胆固醇7，8-脱氢酶的DNA序列，以及大肠杆菌分泌表达胆固醇7，8-脱氢酶的方法；以及基于毕赤酵母密码子偏爱设计优化的重组胆固醇7，8-脱氢酶的DNA序列，以及毕赤酵母分泌表达胆固醇7，8-脱氢酶的方法。
【背景技术】
[0002]维生素D3是人与动物生长、发育、繁殖、维持生命和保持健康必不可少的一种脂溶性维生素。它的主要作用是调节钙磷代谢，促进肠内钙磷吸收和骨质钙化，维持血钙和血磷的平衡。人和动物能从两个途径获取维生素D3, —种途径是通过饮食从一些动植物组织直接获取，另一种途径是通过UV-B波段光照射，将广泛存在于脊椎动物皮肤里的内源物一7-脱氢胆固醇(ProD3),转化成维生素D3前体(PreD3),然后再异构成维生素D3。
[0003]长期以来只有少数发达国家能够生产维生素D3，其生产技术被国际上三大公司(瑞士 Roche公司，德国Basf公司和荷兰Duphar公司)所垄断，并对我国进行严密封锁。中国科学院原感光化学研究所(现理化所组成部分)维生素D3项目组在多年从事光化学研究的基础上，于九十年代初提出一条新的化学合成路线，并取得较好的实验结果。但化学反应步骤多，涉及许多有机试剂的使用，条件不易控制，且副产物多，转化效率低。利用生物技术合成维生素D3是一个较好的选择，目前不管何种技术，制造维生素D3的难点重点都在于怎样合成7-脱氢胆固醇。
[0004]目前，已有以角鲨烯、醋酸盐等为底物合成7-脱氢胆固醇的方法，但由于原材料昂贵、反应步骤繁琐等原因，都无法形成工业化生产。黄时海等也曾通过分子克隆技术，以胆固醇为底物生物转化合成7-脱氢胆固醇，但却忽略了异源的胆固醇脱氢酶基因与大肠杆菌宿主细胞的密码子的差异性，而这可能是进一步提高胆固醇脱氢酶产量的一个限制性因素。密码子优化是一种对异源基因的密码子进行调节已达到适应宿主细胞的密码子的方法。其实际上是通过对同义密码子的改变进而改变基因的核酸序列，却不改变其氨基酸序列。越来越多的证据表明，同义密码子的改变可以通过改变mRNA的二级结构以及改善与宿主细胞tRNA水平的匹配度，进而影响蛋白质的表达。
[0005]综上所述，目前7-脱氢胆固醇的生产存在以下不足:1、部分生产工艺反应条件苛亥|J，对生产设备及生产条件要求较高，增加生产成本；2、部分方法蛋白表达量较低，不适合
工业生产。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的就是针对上述存在的问题与不足，提供一种经密码子优化后的编码胆固醇7，8-脱氢酶的D NA序列。本发明经系统密码子优化，并没有改变mRNA起始端的稳定性，优化后的胆固醇7，8-脱氢酶基因降低了转录能量屏障，提高了转录效率，有效提高了其在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达量。[0007]为实现上述目的，本发明一方面提供了一种编码胆固醇7，8-脱氢酶的基因序列(SEQIDN0.2)，其特征在于，该序列编码了 SEQIDN0.1所示的胆固醇7，8-脱氢酶。
[0008]本发明另一方面提供了一种编码胆固醇7，8-脱氢酶的基因序列(SEQIDN0.3)，其特征在于，该序列编码了 SEQIDN0.1所示的胆固醇7，8-脱氢酶。
[0009]本发明提供了一种原核表达载体pET32a(+)-daf_36，它含有所述的DNA编码序列SEQIDN0.2。
[0010]本发明提供了两种真核表达载体PPIC3.5K-daf-36和pPIC9K_daf-36，它含有所述的DNA编码序列SEQIDN0.3。
[0011]本发明提供了一种大肠杆菌工程细胞BL21(DE3)，它含有所述的原核表达载体pET32a(+)_daf_36。
[0012]本发明提供了两种毕赤酵母工程细胞GS115，它含有所述的真核表达载体pPIC3.5K-daf-36 和 pPIC9K_daf-36。
[0013]为实现上述目的，本发明采用以下技术措施:
[0014]本发明提供了一种密码子经过改造且mRNA 二级结构稳定性高的重组胆固醇7，8-脱氢酶的优化基因，其核苷酸序列为SEQIDN0.2及SEQIDN0.3所示，其特征在于自线虫(Caenorhabditis elegans)中获得具有胆固醇7，8_脱氢酶功能的daf_36基因全序列的基础上，分别改变了 343个碱基及317个碱基，优化后的胆固醇7，8-脱氢酶基因，降低了转录能量屏障，提高了转录效率。由以下方法获得:`
[0015]米用系统密码子优化的方法，对来源于线虫(Caenorhabditis elegans)的daf-36基因的密码子，分别根据E.coli密码子的使用频率及P.pastoris密码子的使用频率进行优化。密码子的优化贯穿整条基因序列。
[0016]本发明所述的编码胆固醇7，8-脱氢酶的优化基因，具有SEQIDN0.2及SEQIDN0.3所示的核苷酸序列，有以下特征:
[0017]本发明自线虫(Caenorhabditis elegans)中获得具有胆固醇7，8_脱氢酶功能的daf-36基因全序列，将该基因在不改变其蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，GC含量的调整，不稳定序列的删除，mRNA 二级结构等影响因素，分别按照大肠杆菌及巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子对该序列进行改造，其中分别改变了 343个碱基及317个喊基。
[0018]本发明要求保护的胆固醇7，8-脱氢酶的重组表达载体，可用如下方法生产。该方法包括:
[0019]1.分别提取 pUC57-daf-36、pET32a(+)、pPIC3.5K 和 pPIC9K 质粒；
[0020]2.分别用EcoR I和Hind III对质粒pUC57_daf-36和pET32a (+)进行双酶切处理，用EcoR I和Not I对质粒pUC57-daf-36、pPIC3.5K和pPIC9K进行双酶切处理；
[0021]3.将daf-36基因片段、表达载体pET32a(+)、pPIC3.5K和pPIC9K酶切产物进行回收后，将目的基因与载体片段分别连接，由此构建了重组表达载体pET32a(+)-daf-36、pPIC3.5K-daf-36 和 pPIC9K_daf-36。
[0022]注:以上提到的大肠杆菌培养基配方如下:
[0023]LB:0.5%Yeast Extract,l%Peptone,l%NaCl, pH 7.2。
[0024]毕赤酵母培养基配方如下:[0025]YPD:l%Yeast Extract,2%Peptone,2%Dextrose(glucose)
[0026]本发明要求保护的含有该胆固醇7，8-脱氢酶重组表达载体的重组宿主菌，可用如下方法生产:
[0027](I)将重组质粒pET32a(+)-daf_36转入E.coli BL21 (DE3)感受态细胞中，构建了大肠杆菌重组表达菌株 E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-daf-36。
[0028]胆固醇7，8-脱氢酶表达情况的检测方法可以采用SDS-PAGE的方法分析，用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE来分析蛋白表达。
[0029](2)将重组质粒 pPIC3.5K-daf-36 和 pPIC9K-daf_36 分别转入 P.pastoris GS115感受态细胞中，构建了毕赤酵母重组表达菌株P.pastor i s GS115/pPIC3.5K_daf-36及P.pastoris GS115/pPIC9K_daf-36。
[0030]胆固醇7，8-脱氢酶表达情况的检测方法可以采用SDS-PAGE的方法分析，用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达。
[0031]本发明提供了一种密码子经过改造且mRNA 二级结构稳定性高的重组胆固醇7, 8-脱氢酶的优化基因，其核苷酸序列为SEQIDN0.2及SEQIDN0.3所示。密码子的优化没有改变mRNA起始端的稳定性，优化后的胆固醇7，8-脱氢酶基因降低了转录能量屏障，提高了转录效率，有效提高了其在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达量。 【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1中图1a胆固醇7，8-脱氢酶(daf-36)原基因密码子使用频率，图1b按大肠杆菌偏爱密码子优化后的胆固醇7，8-脱氢酶基因(daf-36-pl)的密码子使用频率。
[0033]图2中图2a胆固醇7，8-脱氢酶(daf-36)原基因密码子使用频率，图2b按毕赤酵母偏爱密码子优化后的胆固醇7，8-脱氢酶基因(daf-36-p2)的密码子使用频率。
[0034]图3中图3a胆固醇7，8_脱氢酶(daf_36)原基因密码子优化前于大肠杆菌中的表达，图3b胆固醇7，8-脱氢酶(daf-36)原基因密码子优化前于毕赤酵母中的表达。
[0035]图4为大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-daf-36诱导表达胆固醇7, 8-脱氢酶蛋白(12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测)，胆固醇7，8-脱氢酶DAF-36分子量约为49.66kDa，与结果相符。
[0036]图5 为毕赤酵母菌株P.pastoris GS115/pPIC3.5K_daf-36 及P.pastoris GS115/pPIC9K-daf-36诱导表达胆固醇7，8-脱氢酶蛋白(12%SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳检测)，胆固醇7，8-脱氢酶DAF-36分子量约为49.66kDa，与结果相符。
【具体实施方式】
[0037]下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0038]实施例1:胆固醇7，8-脱氢酶基因的优化以及重组大肠杆菌基因工程菌株的构建、筛选及诱导表达，制备的步骤是:
[0039]1.1胆固醇7，8-脱氢酶基因daf-36的优化设计
[0040](I)本发明从线虫(Caenorhabditis elegans)中克隆获得的胆固醇7，8_脱氢酶原始基因(daf-36)序列(SEQIDN0.1)，其原基因全长1287bp，共编码428个氨基酸和一个终止密码子；
[0041](2)通过 http://people, mb1.ucla.edu/sumchan/caltor.html 分析，在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，选用大肠杆菌偏爱密码子；
[0042](3)综合考虑密码子使用频率、GC含量的调整、不稳定序列的删除、mRNA 二级结构稳定性等影响因素，按照大肠杆菌的偏爱密码子，采用系统密码子优化的方法，对胆固醇7, 8-脱氢酶基因(daf-36)序列氨基酸密码子进行改造；
[0043](4)将经密码子优化后的胆固醇7，8-脱氢酶全基因((1&卜36-?1)由人工合成(SEQIDN0.2)，合成后并连接在载体pUC57上。
[0044]1.2胆固醇7，8-脱氢酶重组大肠杆菌基因工程菌株的构建和筛选
[0045]1.2.1胆固醇7，8-脱氢酶基因重组大肠杆菌表达载体的构建
[0046]分别提取pUC57-daf_36、pUC57_daf-36-pl 和 pET32a(+)质粒，并分别用 EcoR I和Hind III对该质粒进行双酶切处理，并分别将daf-36及daf-36-pl基因片段和表达载体pET32a(+)酶切产物进行回收及连接，通过菌液PCR、酶切和测序对阳性克隆进行鉴定，由此构建了大肠杆菌重组表达载体pET32a(+) -daf-36及pET32a(+) -daf-36-pl。
[0047]1.2.2胆固醇7，8-脱氢酶重组大肠杆菌基因工程菌株的构建
[0048]分别将大肠杆菌重组表达载体pET32a (+) -daf-36及pET32a (+) -daf-36-p I转化入E.coli BL21(DE3)表达菌株中，通过菌液PCR鉴定，构建了大肠杆菌重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-daf-36 及 E.coli BL21 (DE3)/pET32a(+)-daf-36-pl。
[0049]1.3胆固醇7，8-脱氢酶DAF-36在大肠杆菌中的诱导及优化表达
[0050]于37°C条件下，添加0.5mM IPTG诱导4h后，用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE来分析蛋白表达。(图3 (a)，图4)
[0051]实施例2:胆固醇7，8-脱氢酶基因的优化以及重组毕赤酵母基因工程菌株的构建和筛选，制备的步骤是:
[0052]2.1胆固醇7，8-脱氢酶基因daf-36的优化设计
[0053](I)本发明从线虫(Caenorhabditis elegans)中克隆获得的胆固醇7，8_脱氢酶原始基因(daf-36)序列，其原基因全长1287bp，共编码428个氨基酸和一个终止密码子；
[0054](2)通过http://www.jcat.de/分析,在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下,选用毕赤酵母偏爱密码子；
[0055](3)综合考虑密码子使用频率、GC含量的调整、不稳定序列的删除、mRNA 二级结构稳定性等影响因素，按照毕赤酵母的偏爱密码子，采用系统密码子优化的方法，对胆固醇
7,8-脱氢酶基因(daf-36)序列氨基酸密码子进行改造；
[0056](4)将经密码子优化后的胆固醇7，8-脱氢酶全基因(daf-36_p2)由人工合成，合成后并连接在载体PUC57上。
[0057]2.2胆固醇7，8-脱氢酶重组毕赤酵母基因工程菌株的构建和筛选
[0058]2.2.1胆固醇7，8-脱氢酶基因重组毕赤酵母表达载体的构建
[0059]分别提取pUC57-daf-36、pUC57_daf-36-p2 和 pPIC3.5K 及 pPIC9K 质粒，并分别用EcoR I和Not I对该质粒进行双酶切处理，并分别将daf-36及daf-36-p2基因片段与表达载体PPIC3.5K及pPIC9K酶切产物分别进行回收及连接，通过菌液PCR、酶切和测序对阳性克隆进行鉴定，由此构建了毕赤酵母重组表达载体PPIC3.5K-daf-36、pPIC9K-daf-36、pPIC3.5K-daf-36-p2 及 pPIC9K_daf-36-p2。
[0060]2.2.2胆固醇7，8-脱氢酶重组毕赤酵母基因工程菌株的构建
[0061]分别将毕赤酵母重组表达载体pPIC3.5K-daf_36、pPIC9K_daf-36、pPIC3.5K-daf-36-p2 及 pPIC9K_daf-36-p2 经 Bgl II 进行线性化后电转化 P.pastorisGS115感受态细胞，通过基因组PCR鉴定，构建了毕赤酵母重组表达菌株P.pastorisGS115/pPIC3.5K-daf-36、P.pastoris GSl15/pPIC9K_daf-36、P.pastoris GS115/pPIC3.5K-daf-36-p2 及 P.pastoris GS115/pPIC9K_daf-36-p2。
[0062]2.3胆固醇7，8-脱氢酶DAF-36在毕赤酵母中的诱导及优化表达
[0063]①挑取单克隆，接种至IOOmL BMGY 中，30°C，250r/min，摇至 0D_=2-6 ；[0064]②室温1500_3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用1/5-1/10原培养基体积的BMMY重悬细胞，进行诱导表达；
[0065]③在250mL摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布，放入摇床继续生长；
[0066]④每24h，加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导；
[0067]⑤在下列的各个时间点，取ImL培养基至1.5mL离心管，分别收集上清及沉淀，存于-80 0C ；
[0068]时间点:12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h。
[0069]⑥用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达。(图3 (b)，图5)
【权利要求】
1.一种编码胆固醇7，8-脱氢酶的基因序列，其特征在于:所述序列为SEQIDN0.2，该序列编码了 SEQIDN0.1所示的胆固醇7，8-脱氢酶。
2.一种含有权利要求1所述的胆固醇7，8-脱氢酶优化基因的重组原核表达载体，其特征在于:所述重组原核表达载体是重组大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组原核表达载体，其特征在于:所述载体为pUC57-daf-36、pUC57-daf-36-pl和 pET32a(+)。
4.一种含有权利要求2所述重组表达载体的基因工程菌，其特征在于:所述的基因工程的宿主菌为大肠杆菌。
5.一种编码胆固醇7，8-脱氢酶的基因序列，其特征在于:所述序列为SEQIDN0.3，该序列编码了 SEQIDN0.1所示的胆固醇7，8-脱氢酶。
6.一种含有权利要求5所述的胆固醇7，8-脱氢酶优化基因的重组真核表达载体，其特征在于:所述重组真核表达载体是重组毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组真核表达载体，其特征在于:所述载体为pUC57-daf-36、pUC57-daf-36-p2 和 pPIC3.5K 及 pPIC9K 质粒。
8.一种含有权利要求5所述重组表达载体的基因工程菌，其特征在于:所述的宿主细胞为毕赤酵母细胞。`
【文档编号】C12N1/19GK103882037SQ201310733457
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】王敏, 申雁冰, 汤睿, 牛丹丹, 格日勒, 郑宇
申请人:天津科技大学