微生物分离培养装置及其方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物分离培养装置及其方法；该装置采用连接件将两个培养瓶的瓶口连接，且连接件中配装过滤组件；该过滤组件是针对目标菌株设置的，因此，将消化培养液经过滤组件过滤后，理论上即可分离出目标菌株，且过滤得到的目标菌株能够通过连接件流入用于富集培养的培养瓶中，由此可知，本发明与现有技术相比，目标菌株的分离以及转移培养更为便利，能够减少操作过程中的可能污染，以提高分离效率、减少各项成本。
【专利说明】微生物分离培养装置及其方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物分离培养装置及其方法，属于微生物分离培养【技术领域】，主要应用于微生物培养过程的杂菌感染监测；另外，本发明所述微生物分离培养装置也可以用于病菌分离培养，便于致病菌种类判断。
【背景技术】
[0002]自然界的微生物包括细菌、真菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、病毒、螺旋体。微生物检测是生命科学领域最基本和最重要的工作。待检样品中常混杂着多种微生物，影响目标微生物的分离和培养，干扰检测结果和效率；因此，根据待检样本的特征以及待检微生物的形态结构、细胞大小、培养条件、生化特性等，选择合适的方法对其进行分离、培养，是微生物检测的前提。
[0003]在对目标微生物进行分离、培养时，常规或传统的方法是采用平皿分离培养法，使其能够分散生长形成单一菌落，以便于观察形态特征或进行生化鉴定。这种过程一般需2~3种培养基；除了对标本或者样品进行必要的预处理外，分离培养一般还需通过特殊的接种方法来完成；常用的接种方法有:分区划线法、倾注平板法、菌落分纯法、斜面接种法、穿刺培养法、液体培养基接种法等；分离培养的操作繁琐复杂，人工和材料成本都比较高。
[0004]微生物种的多样性和待检样本的复杂性，使得目标微生物的分离培养工作成为影响微生物检测的效率与准确度的一个关键技术。普通细菌的分离培养可采用上述传统或常规的平皿分离培养法进行；而对于支原体、L型细菌、某些特殊细菌进行分离培养，则需要采用更为完善的方法与技术 ，原因在于这类菌种分离效率较低，培养增殖困难，从而增加了培养成本。
[0005]支原体是一类缺乏细胞壁、有别于细菌和病毒的原核微生物，其体积微小，直径一般在0.2~0.3 μ m之间，可通过除菌滤膜。支原体种类繁多(约120多种)，分布非常广泛，是人类和非人类动物以及植物几种常见疾病的病原体，也是生物制剂生产中最常见的污染物。工业细胞培养液中存在的支原体污染，既广泛又不易被察觉。支原体生长缓慢，通常培养比较困难，对它的鉴定如果采用液体培养法则假阳性率高，准确性低；如果用固体培养法虽然可以观察到菌落，但判读结果所需时间较长。同时使用两相培养法则操作极为繁琐，且易受环境微生物污染，人工及材料的成本较高。
[0006]L型细菌是一类细胞壁有缺陷、且在普通环境中能够生长和致病的细菌，包括原生质体(革兰氏阳性菌L型)和原生质球(革兰氏阴性菌L型)，营养要求与原菌基本相同，但必须补充特殊营养物质，并加入一定浓度稳定剂以提高培养基的渗透压。某些体积较小的L型细菌可通过除菌滤膜。此类细菌生长较缓慢，培养2~7天才能在平板上形成细小菌落，而在液体培养基中生长后呈较疏松的絮状颗粒沉于管底。
[0007]军团菌系需氧革兰氏阴性杆菌，大小为(0.3~0.4) ym X (2~3)μπι，菌体多形性，呈杆状或线状，可通过除菌滤膜。军团菌包括45个种，其中以嗜肺军团菌最为常见，广泛存在于自然环境中，在温水里及潮热的地方蔓延，常隐藏在包淋浴器、矿泉池、喷泉以及空调设备的冷却水塔等人工供水系统中。本菌生长缓慢，需要3~5日方见菌落。分离培养军团菌，需先对标本作酸处理杀灭其他杂菌，并使用富含半肮氨酸和铁的特殊培养基。
【发明内容】
[0008]本发明针对现有技术的不足，提供一种微生物分离培养装置，该分离培养装置利用能否穿透一般的细菌滤器并在无生命的培养基中生长繁殖等条件，可以分离得到支原体和某些细菌，再通过选择性增殖培养等方法来进行进一步的分离，这样可以减少操作过程中的可能污染，以提高分离效率、减少各项成本。
[0009] 为实现以上的技术目的，本发明将采取以下的技术方案:
一种微生物分离培养装置，包括两个培养瓶，每一个培养瓶的底部通过底盖封接，且两个培养瓶的瓶口之间通过连接件连接，该连接件沿自身轴线开设通孔，所述通孔的孔壁对应于两个培养瓶的瓶口分别设置有一个连接部位，连接件的两个连接部位之间设置有过滤组件安装部位，该过滤组件安装部位安装有用于过滤目标微生物的过滤组件，而每一个培养瓶的瓶口与连接件的相应连接部位之间为可拆卸的密封连接。
[0010]作为本发明的进一步改进，所述的两个培养瓶中，其中一个培养瓶在另一个培养瓶的上方，且两个培养瓶的瓶口相对设置。
[0011]作为本发明的进一步改进，每一个培养瓶的瓶口均设置有外螺纹，所述连接件的两个连接部位均包括开设在通孔孔壁上的内螺纹以及紧邻该内螺纹设置的密封槽，所述培养瓶瓶口的外螺纹与连接件上对应位置处的内螺纹螺纹配合连接，同时培养瓶的瓶口端部通过置于密封槽中的密封件与连接件密封。
[0012]作为本发明的进一步改进，所述的过滤组件包括滤膜以及滤膜固定装置，所述的滤膜固定装置与过滤组件安装部位螺纹配合连接，而滤膜则通过垫片配装在滤膜固定装置上，垫片嵌装在通孔的孔壁紧邻过滤组件安装部位所开设的垫片槽中，而滤膜则位于垫片和滤膜固定装置之间。
[0013]作为本发明的进一步改进，所述的培养瓶中设置有培养支架，该培养支架包括支杆以及培养盘，所述培养盘的开口与培养瓶瓶口朝向一致。
[0014]作为本发明的进一步改进，所述培养盘的盘面与支杆呈倾斜设置。
[0015]本发明的另一个技术目的是提供一种基于上述微生物分离培养装置的微生物分离培养方法，所述微生物分离培养装置中的两个培养瓶，分别为培养瓶1、培养瓶II;所述微生物分离培养方法包括以下步骤:步骤一、待检样本的消化处理一首先，将待检样本接种到备有消化培养液的培养瓶I 100中；接着，通过连接件将培养瓶I 100的瓶口与培养瓶II 300的瓶口连接，且培养瓶I 100的瓶口、培养瓶II 300的瓶口均与连接件密封，同时连接件中配装过滤组件；然后，以培养瓶I 100在下、培养瓶II 300在上的状态，在37度恒温条件下摇瓶培养12~24小时；步骤二、消化培养液的倒置过滤分离——培养瓶I 100在上、培养瓶II 300在下，通过培养瓶II 300的抽滤口 II 302进行负压抽滤，使菌液由培养瓶I 100流向培养瓶II 300 ;步骤三、含有目标菌株的富集液体培养——通过培养瓶I 100的底盖I 101向培养瓶II 300内加入富集培养液，在37度恒温条件下培养12~24小时；步骤四、按照目标菌株的生化特征判断富集液体培养液中是否含有目标菌株。
[0016]作为本发明的进一步改进，步骤四的判断结果表明富集液体培养液中含有目标菌株，则继续进行如下操作:步骤五、更换新的培养瓶I 100、连接件及连接件内的配件，再将备有固体培养基的培养支架800置入新更换的培养瓶I 100内，培养盘801的正面朝向培养瓶I 100的瓶壁外侧，盖好底盖I 101 ;步骤六、将步骤五组装好的装置倒置，即培养瓶I 100在下、培养瓶II 300在上，通过抽滤口 I 102进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶I 100，菌液浸没培养支架800，并接种到培养盘801内的固体培养基上；步骤七、将上述装置再次倒置，即培养瓶I 100在上、培养瓶II 300在下，通过抽滤口 II 302进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶II 300 ;步骤八:将上述装置置于培养箱内，并在适合目标菌株的温度下培养24~48小时；步骤九:观察培养支架800上培养盘801中的菌落形态。
[0017]作为本发明的进一步改进，在步骤二和步骤六中，进行负压抽滤时，将所述瓶盖I 101旋松。
[0018]作为本发明的进一步改进，在步骤六中，进行负压抽滤时，将所述瓶盖II 301旋松。
[0019]根据以上的技术方案，相对于现有技术，本发明具有以下的优点:
本发明采用连接件，将用于消化培养的培养瓶和用于富集培养的培养瓶连接，并在连接件中配装过滤组件，该过滤组件是针对目标菌株设置的，因此，将消化培养液经过滤组件过滤后，理论上即可分离出目标菌株，且过滤得到的目标菌株能够通过连接件流入用于富集培养的培养瓶中 ，由此可知，本发明与现有技术相比，目标菌株的分离以及转移培养更为便利，能够减少操作过程中的可能污染，以提高分离效率、减少各项成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明所述的微生物分离培养装置的结构示意图。
[0021]图2为图1中局部I的纵切面的放大的示意图。
[0022]图3为图2中瓶盖的纵切面的放大的示意图。
[0023]图4为图2中瓶盖的立体示意图。
[0024]图5为图2中滤膜固定装置的立体示意图。
[0025]图6为培养支架实施例一的立体示意图。
[0026]图7为培养支架实施例二的立体示意图。
[0027]图8为图7的纵切面的示意图。
[0028]图9是培养体系中P[CO2]/P [02]的变化曲线，其中:横坐标为液体培养基中特定微生物的细胞数量(Cell/ml )，纵坐标为Index=P [CO2]/P [02]。
[0029]其中:培养瓶I 100 ;底盖I 101 ;抽滤口 I 102 ;外螺纹I 103 ;瓶盖200 ;通孔201 ;内螺纹I 211 ;内螺纹II 212 ;内螺纹III213 ;密封槽I 221 ;密封槽II 222 ;垫片槽223 ；培养瓶II 300 ;底盖II 301 ;抽滤口 II 302 ;外螺纹II 303 ;密封圈I 401 ;密封圈II 402 ;垫片500 ;滤膜600 ;滤膜固定装置700 ;十字通孔701 ;外螺纹II 702 ;培养支架800 ;培养盘801 ；支杆802。
【具体实施方式】
[0030]附图非限制性地公开了本发明所涉及优选实施例的结构示意图；以下将结合附图详细地说明本发明的技术方案。[0031]参见图1至图5，本发明所述的微生物分离培养装置，包括瓶口带有外螺纹I 103的培养瓶I 100与侧壁带有内螺纹I 211、盖中央带有通孔201的瓶盖200以及瓶口设有外螺纹II 303的培养瓶II 300。所述内螺纹I 211的顶部内侧设置密封槽I 221，所述密封槽
I221内设有密封圈I 401，所述培养瓶I 100的外螺纹I 103与瓶盖200的内螺纹I 211连接。所述培养瓶I 100的瓶口肩部设置抽滤口 I 102，并在培养瓶I 100内设置培养支架800，如图6~图8所示。所述培养瓶II 300的底部设置底盖II 301、瓶口肩部设置抽滤口 II 303。
[0032]所述瓶盖200的侧壁反向延长、并在瓶盖200反向延长的侧壁内侧从下往上依次设置内螺纹II 212和内螺纹III 213，所述内螺纹II 212的内直径小于内螺纹III 213的内直径，通孔201的内直径小于内螺纹II 212的内直径，内螺纹II 212的底部内侧设置垫片槽223，内螺纹III 213的底部内侧设置密封槽II 222，所述密封槽II 222内放置密封圈II 402。所述瓶盖200的内螺纹III 213与培养瓶II 300的外螺纹II 303连接。
[0033]所述瓶盖200内依次设置垫片500、滤膜600、滤膜固定装置700，所述滤膜固定装置700为中央开设十字通孔701、外壁设有外螺纹II 702的圆柱体，所述垫片500设置在垫片槽223内，滤膜固定装置700的外螺纹II 702与瓶盖200的内螺纹II 212连接。
[0034]所述培养瓶I 100、瓶盖200、培养瓶II 300、密封圈I 401、密封圈II 402、垫片500、滤膜600、滤膜固定装置700和培养支架800的中心均同轴。
[0035]由此可知，本发明所述的瓶盖200事实上为一连接件，该连接件具有两个连接部位(内螺纹I 211、内螺纹III 213、密封槽I 221、密封槽II 222)，以分别与培养瓶I 100的瓶口和培养瓶II 300的瓶口实现密封连接，且这样的连接方式是可拆卸的，因此，除了上述公开的螺纹连接方式外，卡扣连接也适用于本发明所述的技术方案；同时所述的两个连接部位之间，设置过滤组件安装部位(内螺纹II 212)，以进行用于分离待筛选菌株的过滤组件的安装；过滤组件包括滤膜600、滤膜固定装置700，通过滤膜600的选择，进行待筛选菌株的分离。
[0036]本发明主要用于分离培养支原体、L型细菌、衣原体、少数立克次氏体、病毒，因此，滤膜600可以为一般的细菌滤膜；上述的支原体、L型细菌、衣原体、少数立克次氏体、病毒均可通过一般的细菌滤膜。
[0037]以下将以肺炎支原体的分离培养作为案例，具体地说明上述分离培养装置的使用。
[0038]一、消化复苏。
[0039]步骤一:将临床痰样本接种到备有消化培养液的培养瓶I 100中；所述消化培养液为含丰富营养物质、消化酶及抑菌药物的选择性增菌、消化培养液，该消化培养液具有解离分散痰样本、抑制杂菌污染、释放并复苏肺炎支原体的作用。
[0040]步骤二:培养瓶I 100上依次装配设置有密封圈I 401、密封圈II 402、垫片500、滤膜600、滤膜固定装置700的瓶盖200和培养瓶II 300，盖好底盖II 301。
[0041]步骤三:将上述装置以培养瓶I 100在下、培养瓶II 300在上的状态置于摇床上，在37度恒温条件下培养12~24小时。
[0042]二、富集增殖。 [0043]步骤四:将上述装置倒置，即培养瓶I 100在上、培养瓶II 300在下，通过培养瓶II300的抽滤口 II 302进行负压抽滤，滤膜600阻隔杂菌，而使菌液中的肺炎支原体透过滤膜600由培养瓶I 100流向培养瓶II 300。为使菌液流动通畅，可通过旋松瓶盖I 101实现。
[0044]步骤五:通过培养瓶I 100的底盖I 101向培养瓶II 300内加入足量的富集培养液，在37度恒温条件下培养12~24小时；所述富集培养液，主要功能是对通过滤膜的某一种特定微生物进行选择性增菌培养，为含丰富营养物质、抑菌药物和/或变色指示剂的选择性增菌、富集培养液，可根据检测需要进行配制，〈例如:富含胱氨酸和铁离子的培养基利于军团菌的生长；培养基中加入10~20%人或动物血清可提供支原体生长所需的营养成分；L型细菌必须在高渗的环境中生长等；在培养液中添加或减少一种或多种特定的营养成分或某些选择试剂，如抗菌素或抑菌肽，可达到选择性增殖某一类微生物的目的〉，对于本实施例而言，该富集培养液具有抑制杂菌污染、富集肺炎支原体、指示肺炎支原体生长的作用。
[0045]步骤六:通过肉眼和\或仪器观察培养瓶II 300中培养液的浑浊程度、颜色变化、有无荧光现象，或加入试剂进行进一步的观察。
[0046]“可通过滤膜”的特定微生物经过前述消化处理、倒置过滤分离、液体培养后，已具备一定的细胞量；进行固体增菌培养，要求微生物的数量在合理的范围，如数量太少则其在固体培养基上生长一定时间后，会过于稀疏或漏检；如数量太多则会密集成膜，无法形成单一菌落，给后续的生化试验等鉴定带来不便。选择合适的时机将微生物从液体培养基转接到固体培养基上至关重要。支原体生长过程中，会消耗体系中的氧气，代谢并向环境中释放二氧化碳；因此可以通过监测培养体系中p[co2]/p[o2]的变化来判断微生物在单位统计中的数量是否符合要求。
[0047]完成步骤六之后 ，可采用下列两种方法中的一种或两种，监测培养体系中P[C02]/p[02]的变化，判断特殊微生物(例如支原体等)的在单位统计中的数量:
(1)C02/02指示剂:更换新的培养瓶1、瓶盖及瓶盖内的配件，再安装上含有co2/o2指示剂的特定装置，从而判定细胞数；
(2)CO2ZO2荧光传感器:更换新的培养瓶1、瓶盖及瓶盖内的配件，再连接C02/02荧光传感器，通过测定特定物质的荧光特性，来监测体系中p[co2]/p[o2]的变化，从而判断细胞数。
[0048]若体系中的特殊微生物(例如支原体等)的细胞数已经达到固体培养的要求,则继续进行后续操作。
[0049]三、分离培养。
[0050]若在步骤六中，所述培养瓶II 300中培养液鉴定为肺炎支原体呈阳性，则继续进行如下操作。
[0051]步骤七:更换新的培养瓶I 100、瓶盖200及瓶盖200内的配件，再将备有固体培养基的培养支架800置入培养瓶I 100内，培养盘801的正面朝向培养瓶I 100的瓶壁外侦U，盖好底盖I 101。所述固体培养基为分离培养基、选择性培养基、生化鉴别培养基中的一种或多种；这类培养基包括但不限于显色培养基，或者是一种培养基，在菌落形成后能和随后加入的特定化合物起反应，并呈现出一些外观的变化，如:变色、产生气泡等；该类培养基具有分离，筛选，鉴别肺炎支原体的作用。[0052]固体培养基的配制:富含胱氨酸和铁离子的培养基利于军团菌的生长；培养基中加入10~20%人或动物血清以提供支原体生长所需的胆固醇；L型细菌必须在生存在高渗环境中，立克次氏体和衣原体则必须寄生于细胞内，不能在人工培养基中生长等。
[0053]步骤八:将上述组装好的装置倒置，即培养瓶I 100在下、培养瓶II 300在上，通过抽滤口 I 102进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶I 100，菌液浸没培养支架800，并接种到培养盘801内的固体培养基上。滤膜600再次起阻隔杂菌的作用。为使菌液流动通畅，可通过旋松瓶盖底盖II 301实现。
[0054]步骤九:将上述装置再次倒置，即培养瓶I 100在上、培养瓶II 300在下，通过抽滤口 II 302进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶II 300。为使菌液流动通畅，可通过旋松瓶盖I 101实现。
[0055]步骤十:将上述装置置于培养箱内，并在适合肺炎支原体的温度下培养24~48小时。[0056]步骤十一:通过肉眼和\或仪器观察上述装置内培养支架800上培养盘801中菌落形态。
[0057]另外，本发明所述的消化培养基、富集培养基以及固体培养基均是针对目标菌株进行配制的；由于本发明主要用于是否感染目标菌株的检测，因此，前述的各培养基均是采用现有技术中的成熟配方；即本发明的改进点主要在于装置部分以及基于装置的使用方法。
【权利要求】
1.一种微生物分离培养装置，包括两个培养瓶，其特征在于，每一个培养瓶的底部通过底盖封接，且两个培养瓶的瓶口之间通过连接件连接，该连接件沿自身轴线开设通孔，所述通孔的孔壁对应于两个培养瓶的瓶口分别设置有一个连接部位，连接件的两个连接部位之间设置有过滤组件安装部位，该过滤组件安装部位安装有用于过滤目标微生物的过滤组件，而每一个培养瓶的瓶口与连接件的相应连接部位之间为可拆卸的密封连接。
2.根据权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述的两个培养瓶中，其中一个培养瓶在另一个培养瓶的上方，且两个培养瓶的瓶口相对设置。
3.根据权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，每一个培养瓶的瓶口均设置有外螺纹，所述连接件的两个连接部位均包括开设在通孔孔壁上的内螺纹以及紧邻该内螺纹设置的密封槽，所述培养瓶瓶口的外螺纹与连接件上对应位置处的内螺纹螺纹配合连接，同时培养瓶的瓶口端部通过置于密封槽中的密封件与连接件密封。
4.根据权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述的过滤组件包括滤膜以及滤膜固定装置，所述的滤膜固定装置与过滤组件安装部位螺纹配合连接，而滤膜则通过垫片配装在滤膜固定装置上，垫片嵌装在通孔的孔壁紧邻过滤组件安装部位所开设的垫片槽中，而滤膜则位于垫片和滤膜固定装置之间。
5.根据权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述的培养瓶中设置有培养支架，该培养支架包括支杆以及培养盘，所述培养盘的开口与培养瓶瓶口朝向一致。
6.根据权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述培养盘的盘面与支杆呈倾斜设置。
7.一种基于权利要求2所述微生物分离培养装置的微生物分离培养方法，其特征在于，所述微生物分离培养装置中的两个培养瓶，分别为培养瓶1、培养瓶II;所述微生物分离培养方法包括以下步骤:步骤一、待检样本的消化处理一首先，将待检样本接种到备有消化培养液的培养瓶I (100)中；接着，通过连接件将培养瓶I (100)的瓶口与培养瓶II(300)的瓶口连接，且培养瓶I (100)的瓶口、培养瓶II (300)的瓶口均与连接件密封，同时连接件中配装过滤组件；然后，以培养瓶I (100)在下、培养瓶II (300)在上的状态，在37度恒温条件下摇瓶培养12~24小时；步骤二、消化培养液的倒置过滤分离——培养瓶I(100)在上、培养瓶II (300)在下，通过培养瓶II (300)的抽滤口 II (302)进行负压抽滤，使菌液由培养瓶I (100)流向培养瓶II (300);步骤三、含有目标菌株的富集液体培养——通过培养瓶I (100)的底盖I (101)向培养瓶II (300)内加入富集培养液，在37度恒温条件下培养12~24小时；步骤四、按照目标菌株的生化特征判断富集液体培养液中是否含有目标菌株。
8.根据权利要求7所述的微生物分离培养方法，其特征在于，步骤四的判断结果表明富集液体培养液中含有目标菌株，则继续进行如下操作:步骤五、更换新的培养瓶I(100)、连接件及连接件内的配件，再将备有固体培养基的培养支架(800)置入新更换的培养瓶I (100)内，培养盘(801)的正面朝向培养瓶I (100)的瓶壁外侧，盖好底盖I (101)；步骤六、将步骤五组装好的装置倒置，即培养瓶I (100)在下、培养瓶II (300)在上，通过抽滤口 I (102)进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶I (100)，菌液浸没培养支架(800)，并接种到培养盘(801)内的固体培养基上；步骤七、将上述装置再次倒置，即培养瓶I (100)在上、培养瓶II (300)在下，通过抽滤口 II (302)进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶II (300);步骤八:将上述装置置于培养箱内，并在适合目标菌株的温度下培养24~48小时；步骤九:观察培养支架(800)上培养盘(801)中的菌落形态。
9.根据权利要求8所述的微生物分离培养方法，其特征在于，在步骤二和步骤六中，进行负压抽滤时，将所述 瓶盖I (101)旋松。
10.根据权利要求8所述的微生物分离培养方法，其特征在于，在步骤六中，进行负压抽滤时，将所述瓶盖II (301)旋松。
【文档编号】C12N1/00GK103937662SQ201310741589
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2012年12月31日
【发明者】赵万千, 王海晶, 杨扬, 杨焱焱 申请人:江苏嘉语生物医药技术有限公司