大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成s-腺苷甲硫氨酸的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的制备方法，其基本过程为：首先将含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（SAMS）的大肠杆菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS与酿酒酵母分别在适宜的条件下培养后，按一定比例进行混合偶联生成SAM；然后使用有机溶剂作为通透剂使合成的SAM分泌到细胞外；最后采用高效液相色谱技术对SAM进行分析检测。本发明为SAM的廉价生产提供了一条新的途径，是一种操作简便，工艺简单的整细胞催化ATP和L-Met合成SAM的方法。
【专利说明】大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法。
【背景技术】
[0002]S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosy 1-methionine, SAM)是广泛存在于动物、植物和微生物体内一种重要的中间代谢产物。在人体内，SAM是一种重要的生理活性物质,参与多种生化反应。SAM由于具有重要生理作用而引起人们的广泛关注。经过多年的临床应用研究表明，SAM是目前效果最好、功能最多、适用面最广的一种既可作为疾病治疗药物，又可作为食品营养强化剂的物质。它可用于治疗肝病、抑郁症及关节炎等疾病，也是抗衰老的高级保健药物。由于其具有起效快、副作用小、安全可靠等特点，目前美国FDA已正式批准了 SAM的肠溶剂和胶囊作为非处方药；同时美国FDA还批准SAM作为保健品上市。在我国，SAM临床应用主要集中在肝病方面。我国是肝炎的流行大国，据统计，目前我国还没有一种能真正改善肝细胞代谢的生物药物。因此，在国内开发SAM药物意义重大。
[0003]SAM的制备方法主要有化学合成法、酶促转化法及微生物发酵法。其中，化学合成法是采用S-腺苷同型半胱氨酸和甲基供体合成，但其产率低、反应底物价格昂贵，因此未能应用于工业化生产。酶促转化法是利用SAM合成酶(SAMS)来催化ATP和L-甲硫氨酸(L-Met)以合成SAM。但一方面SAM合成酶需要进行分离纯化后方可作为生物催化剂使用，从而增加了生产成本；另一方面SAM的合成还需要价格昂贵的ATP作为底物，因此，目前酶促转化法一般只合成同 位素标记的SAM用于科学研究，若用于工业化生产还有待于进一步改进和探索。微生物发酵法是现在应用最广泛，同时成本也最低廉的方法。某些微生物可以通过细胞代谢积累SAM,尤其是糖酵母属(Saccharomyces)的一些菌株,在培养基中添加一定量外源L-甲硫氨酸(L-Met)便能够在细胞内催化ATP与L-Met反应，合成较高浓度的SAM。尽管微生物发酵法克服了酶促转化法利用昂贵ATP及需要对SAM合成酶进行分离纯化等缺点，但合成的SAM主要累积在酵母细胞内，在分离纯化SAM过程中，首先需破碎较厚的酵母细胞壁，然后再经过复杂的分离纯化步骤，最后才能获得纯度较高的SAM。而酵母细胞的破壁问题目前在工业化生产中仍是一个主要瓶颈，同时复杂的分离纯化步骤也使SAM的最终产率较低。以L-Met计算，发酵法生产SAM的产率只有15%~30%，从而造成SAM的生产成本较高。因此，如何进一步高效合成大量SAM及简化SAM的分离纯化工艺，以期大幅度提高SAM的产量，将有利于推进我国SAM大规模工业化生产的进程。
[0004]SAM 是由 S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC2.5.1.6, S-Adenosyl-methionine-synthetase，SAMS)在ATP存在的条件下催化L-甲硫氨酸(L-Met)合成的。影响合成过程的重要因素包括:S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的活性及ATP的供给。前者主要影响生物合成的效率，而后者则与过程的经济性紧密相关。由于在反应过程中直接添加ATP是经济上所不合适的，因此，对于这类需要ATP的生物合成过程，能否引入一个有效的ATP合成系统，并与SAM合成系统相协调构成一个耦合系统，即ATP再生系统，直接影响反应过程的经济性和效率。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于提供一种针对上述现有技术的不足，提供一种利用大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法，以解决现阶段生产SAM方法中存在的成本高、分离纯化困难等问题。
[0006]为解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是:
一种大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法，包括以下步骤:
(1)将含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)的大肠杆菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS与酿酒酵母分别在适宜的条件下发酵培养后收集菌体；
(2)按一定比例将上述大肠杆菌与酿酒酵母菌体进行混合偶联，并加入耦合系统反应液；其中，大肠杆菌提供SAMS及合成SAM的场所，酿酒酵母提供足够的ATP ；
(3)使用有机溶剂作为通透剂对偶联细胞进行通透化处理，使SAM在大肠杆菌中合成，并被分泌到细胞外；
(4)反应结束后离心收集上清，得到S-腺苷甲硫氨酸。
[0007]所述步骤(1)中，大肠杆菌工程菌株BL21/pET-28a_SAMS的培养过程为:将含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)的大肠杆菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS培养到0D_为0.5~1.5时，加入2~8 mg/mL`乳糖或0.f 1.0 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，诱导温度为25~37°C，诱导时间为5~16 h，以诱导表达一定量的S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS。
[0008]所述步骤(1)中，酿酒酵母的培养过程为:将酿酒酵母在摇床转速17(T200 r/min、温度28~30°C条件下，培养时间17~22 h。
[0009]所述步骤(2)中，所述大肠杆菌BL21/pET-28a_SAMS与酿酒酵母湿菌体质量混合比例为0.5~5:1。
[0010]所述步骤(2)中，稱合系统反应液包括:200 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L腺苷(Ado), I mmol/L 单磷酸腺苷(AMP),0.1 mmol/L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD), 30 mmol/LMgCl2 ? 6H20, 30mmol/L L-蛋氨酸(L-Met), 200 mmol/L 憐酸钾缓冲液，用 0.5 mol/L 氢氧化钾调pH=7.0。
[0011]所述步骤(3)中，以0.5~6%甲苯或0.5%甲醇或0.5%丙酮作为所述的通透剂。
[0012]所述步骤(3)中，其反应条件为:摇床转速为15(T200r/min、温度为25~37°C，偶联反应2~8 h。
[0013]采用上述方案后，由于本发明利用含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的重组大肠杆菌和酵解途径酶活性较强的酿酒酵母，经过对细胞进行通透性处理后，不进行固定化操作而直接将两种菌体混合，由其完整的酶系构建一个ATP再生系统和SAM合成系统。即以大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主细胞，转化带有编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)的重组质粒pET-28a-SAMS，获得了一株具有SAM合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳，并且能够重复使用的重组大肠杆菌菌株BL21/pET-28a-SAMS。在此基础上，利用重组大肠杆菌BL21/pET-28a-SAMS中的S-腺苷甲硫氨酸合成酶系和酿酒酵母中的ATP生物合成酶系，构建了一个以葡萄糖为能源的种间耦合ATP再生系统以合成SAM，并将合成产物SAM有效地分泌到细胞外。本发明一方面避免了额外添加昂贵的ATP ;另一方面由于SAM被分泌到细胞外，可大大简化其分离纯化工艺。因此，本发明提供了一种廉价生产S-腺苷甲硫氨酸的新方法，是一种操作简便，工艺简单的整细胞催化ATP和L-Met合成SAM的方法。目前国内未见到利用大肠杆菌与酿酒酵母偶联生成S-腺苷甲硫氨酸的报道。
[0014]更具体而言，本发明具有如下特点:
1.本发明使用能大量表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶的重组菌作为酶源催化合成SAM，为偶联时催化合成SAM提供了大量廉价的酶源。
[0015]2.本发明使用酵解途径酶活性较强的酿酒酵母产生ATP，为催化合成SAM提供了大量廉价的ATP。
[0016]3.本发明使用有机溶剂甲苯作为通透剂对用于催化偶联合成SAM的细胞进行通透性处理，以保证底物及产物在细胞内外的扩散传递，尤其是确保酵母生成的ATP能够顺利转移至工程菌进行SAM的合成。经通透处理的细胞催化SAM合成的产率得到大幅度的提高，大大提高了 SAM合成酶的利用率。
[0017]4.本发明利用大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸，由于产物是分泌到胞外，可大大简化SAM的后续的分离纯化工艺。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1A为HPLC检测SAM标准品色谱图；
图1B为HPLC检测大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成SAM样品色谱图； 图2为SAM标准曲线。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明作进一步详述。
[0020]一、大肠杆菌工程菌株BL21/pET-28a_SAMS (本实验室构建)的培养:
1.培养基:LB培养基(酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.0)，固体LB培养基中含有2%的琼脂。根据需要添加50呢/mL卡那霉素。
[0021]2.培养方法:从含有50呢/mL卡那霉素的固体LB培养基上挑取大肠杆菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS单菌落接种至装有30 mL的含有50吒/mL卡那霉素LB (LK)培养基的250 mL三角瓶中培养，在摇床转速为180 r/min、温度为37°C条件下，培养12 h左右。将培养液按1% (v/v)的接种量接种至装有100 mL的LK培养基的250 mL三角瓶中进行培养，温度37°C，摇床转速180 r/min，当菌体培养至对数生长中期(OD6tltl=L 5左右)时,加入4 mg/mL乳糖进行诱导表达重组SAMS。其中，诱导温度为30°C，诱导时间为8h。诱导表达结束后的培养液在4°C下、12000 Xg离心20 min，收集菌体，再用冰冷的20mmol/L磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，以用于后续的偶联系统。
[0022]二、酿酒酵母(本实验室储藏)的培养:
1.培养基:斜面培养基的组成为8°P麦汁，琼脂2%，pH 5.5 ;液体培养基(g/L)的组成为葡萄糖20，蛋白胨20， 酵母膏10，pH 5.5。
[0023]2.培养方法(I)斜面培养:接种后的斜面置于30°C恒温培养箱中培养2天，保藏于冰箱冷藏室，每月至少转接一次。
[0024](2)液体培养:将斜面种子30°C活化3-4 h，取一环菌体接种至装有50mL的液体培养基的250 mL三角瓶中培养，在摇床转速180 r/min、温度30°C条件下，培养时间19 h。然后将培养好的培养液按照10% (v/v)的接种量，接种至装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中进行培养，发酵，在摇床转速180 r/min、温度30°C条件下，培养18 h。培养液在4°C下、6000 Xg离心20 min,收集菌体,再用冰冷的20 mmol/L磷酸钾缓冲液洗漆菌体2次，以用于后续的偶联系统。
[0025]三、大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸:
按4:1的比例称取大肠杆菌BL21 (pET-28a-SAMS)与酿酒酵母湿菌体进行混合，加入率禹合系统反应液(包括:200 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L腺苷(Ado), I mmol/L单磷酸腺苷(AMP), 0.1 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，30 mmol/L MgCl2 *6H20,30 mmol/L L-蛋氨酸(L-Met), 200 mmol/L磷酸钾缓冲液，用0.5 mol/L氢氧化钾调pH=7.0)，加入5%(v/v)甲苯，在摇床转速180 r/min、温度37°C条件下，振荡反应5 h后离心收集上清，测定上清中SAM含量。
[0026]四、S-腺苷甲硫氨酸含量的测定
样品中SAM的含量可通过HPLC的反相C18柱进行分析检测，具体测定条件为:流动相为0.01mol/L甲酸铵(甲酸调pH3.5，0.22Mm水膜过滤):甲醇=97:3，流速I mL/min，柱温30°C，检测波长254 nm。检测结果见图1A及图1B。
[0027]采用外标法 ，根据不同浓度的SAM标准品峰面积绘制的标准曲线(见图2)对样品中的SAM进行定量。当添加50 mg (菌体)/mL缓冲液时，SAM浓度可达55 mg/1,即每毫克菌体产生SAM量为1.2。
[0028]以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施的范围。故但凡依本发明的权利要求和说明书所做的变化或修饰，皆应属于本发明专利涵盖的范围之内。
【权利要求】
1.一种大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的大肠杆菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS与酿酒酵母分别在适宜的条件下发酵培养后收集菌体； (2)按一定比例将上述大肠杆菌与酿酒酵母菌体进行混合偶联，并加入耦合系统反应液；其中，大肠杆菌提供SAMS及合成SAM的场所，酿酒酵母提供足够的ATP ； (3)使用有机溶剂作为通透剂对偶联细胞进行通透化处理，使SAM在大肠杆菌中合成，并被分泌到细胞外； (4)反应结束后离心收集上清，得到S-腺苷甲硫氨酸。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，大肠杆菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS的培养过程为:将含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的大肠杆菌工程菌株BL21/pET-28a-SAMS培养到OD6tltl为0.5~1.5时,加入2~8 mg/mL乳糖或0.1^1.0 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖苷作为诱导剂，诱导温度为25~37 °C，诱导时间为5~16 h，以诱导表达一定量的S-腺苷甲硫氨酸合成酶 SAMS。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，酿酒酵母的培养过程为:将酿酒酵母在摇床转速17(T200 r/min、温度28~30°C条件下，培养时间17~22 h。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中，所述大肠杆菌与酿酒酵母湿菌体质量混合比例为0.5~5:1。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中,稱合系统混合反应液包括:200 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L腺苷，I mmol/L单磷酸腺苷，0.1 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，30 mmol/L MgCl2 *6H20,30mmol/L L-蛋氨酸,200 mmol/L磷酸钾缓冲液，用0.5 mol/L氢氧化钾调pH=7.0。
6.根据权利要求1所述的大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中，以0.5飞％甲苯或0.5%甲醇或0.5%丙酮作为所述的通透剂。
7.根据权利要求1或6所述的大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中，其反应条件为:摇床转速为15(T200 r/min、温度为25~37°C，偶联反应2~8 h。
【文档编号】C12P19/40GK103757086SQ201410009868
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】杜翠红, 魏晓楠 申请人:集美大学