抗mif抗体的制作方法

抗mif抗体的制作方法
【专利摘要】本申请涉及单克隆抗体和其抗原结合部分，其可特异性地结合至巨噬细胞游走抑制因子（MIF）的C末端或者中心区域。这些抗MIF抗体和其抗原结合部分进一步地抑制人MIF的生物功能。本申请也涉及来源于抗MIF抗体的被分离的免疫球蛋白重链和轻链以及编码这些免疫球蛋白的核酸分子。本申请也涉及鉴别抗MIF抗体的方法、含有这些抗体的组合物以及使用这些抗体和组合物用于治疗MIF相关疾病的方法。
【专利说明】抗MIF抗体
[0001]本申请是基于以下中国专利申请的分案申请:
[0002]原案申请日:2008年12月30日
[0003]原案申请号:200880127872.7 (PCT/EP2008/011146)
[0004]原案申请名称:抗MIF抗体
【技术领域】
[0005]本发明涉及单克隆抗体和其抗原结合部分，其可特异性地结合至巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的C末端或者中心区域。这些抗MIF抗体和其抗原结合部分进一步地抑制人MIF的生物功能。本发明也涉及来源于抗MIF抗体的被分离的免疫球蛋白重链和轻链以及编码这些免疫球蛋白的核酸分子。本发明也涉及识别抗MIF抗体的方法、含有这些抗体的组合物以及使用这些抗体和组合物用于治疗MIF相关疾病的方法。
【背景技术】
[0006]巨噬细胞游走抑制因子(MIF)最初是基于能够抑制巨噬细胞体外随意移动的能力而被分离的细胞因子(Bloom 等人，Sciencel966，153，80-2;David 等人，PNAS1966，56，72-7)。虽然自从1966年人们已经知道MIF，但是并不知道它在大多数细胞中准确的功能，然而MIF似乎是天生的和获得性免疫反应的关键的上游调节剂。
[0007]在1989 年，人 MIF 的 cDNA 被克隆(Weiser 等人，PNAS1989，86，7522-6)，并且它的基因组定位在染色体22上。MIF基因产物是分子量为12.5kDa的氨基酸蛋白。此蛋白在人、小鼠、大鼠和牛的MIF之间的序列同源性上是高度保守的，同源性为90-96%。然而，MIF与其他任何蛋白没有显著的序列同源性。MIF的三维结构不像任何其他的细胞因子或者脑垂体激素。蛋白结晶成相同亚基的三聚体。每个单体包含两个反向平行的0-螺旋，0-螺旋堆集成有四条链的β_折叠。该单体有另外两个β_链，它们与相邻的亚基的β_折叠相互作用形成单体之间的交界面。三个β_折叠排列形成桶，该桶含有溶剂可到达的通道，此通道沿着分子的三折叠轴穿过蛋白的中心(Sun等人，PNAS1996，93，5191-5196)。
[0008]已经有报导称很低浓度的糖皮质激素就可以诱导巨噬细胞分泌MIF (Calandra等人，Naturel995, 377,68-71 )。然而，作为促炎细胞因子(proinf lammatory cytokine), MIF也可也反向调节糖皮质激素的作用并刺激其它细胞因子如肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-1 β的分泌(Baugh等人，Crit Care Med2002，30，S27-35)，从而假定在炎性和免疫性疾病的发病机理上的作用。MIF也与淋巴瘤、黑素瘤和结肠癌的生长直接相关(Nishihira等人，J Interferon Cytokine Res.2000, 20:751-62)。
[0009]MIF是许多病理状况的中介体，因此与多种疾病相关联，包括炎症性肠病(IBD)、类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘、肾小球肾炎、IgA肾小球肾炎、癌症、心肌梗死(MI)和脓毒。
[0010]多克隆和单克隆抗MIF抗体已经被开发用来对抗重组人MIF (Shimizu等人,FEBSLett.1996; 381,199-202; Kawaguchi 等人,J.Leukoc.Biol.1986, 39, 223-232, and Weiser等人，Cell.1mmunol.1985，90，167-78)。
[0011]已经有人建议，抗MIF抗体可用于抑制TNF-α释放的治疗应用。Calandra等人(J.1nflamm.1995.47，39-51)报导使用抗MIF抗体可以保护动物免予实验诱导的革兰氏阴性和革兰氏阳性的败血性休克。表明抗MIF抗体作为一种治疗方法可用来调节在败血性休克及其他炎性疾病状态下的细胞因子的产生。
[0012]美国专利6，645，493公开了来源于杂交瘤细胞的单克隆抗MIF抗体，它压制了 MIF的生物活性。在动物模型中可以看到这些来源于小鼠的抗MIF抗体在内毒素诱导的休克的治疗上取得了有益效果。一些被描述的抗MIF抗体(II1.D.9，XIV.14.3和XIV.15.5)在本发明中被用于比较试验。
[0013]美国专利2003/0235584公开了在动物中制备MIF的高亲和性抗体的方法，其中MIF基因已经被纯合地敲除。
[0014]Galat 等人描述了糖基化抑制因子(GIF)蛋白(Eur.J.Biochem.1994，224，417-21)。MIF 和 GIF 现在被认为是相同的。Watarai 等人(PNAS2000，97，13251-6)描述了与不同GIF抗原表位相结合的多克隆抗体以便确定Ts细胞中GIF翻译后修饰的生物化学本质。Watarai等人(PNAS2000，97，13251-6)报导了体外GIF出现的不同构象同工型。一种类型的异构体是通过单个半胱氨酸残基的化学修饰而生成的。该化学修饰导致了 GIF蛋白内部的构象变化并改变了它的生物功能。
[0015]考虑到MIF参与多种疾病的复杂性，迫切需要对抗原表位特异性的抗MIF抗体功能和其在医疗方法上的应用进行说明。因此，存在着抗原表位特异性抗MIF抗体的需求，该抗体抑制人MIF用于治疗被MIF介导的疾病和状况的生物功能。

【发明内容】

[0016]本发明涉及抗体和其抗原结合部分，其可特异性地结合至巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的C末端或者中心区域。
[0017]本发明进一步地涉及编码这些抗体或者其抗原结合部分的核酸分子，并且涉及包含这种核酸的载体和包含这种载体的寄主细胞，而且还涉及用于重组生产被核酸分子编码的多肽的方法。
[0018]本发明也涉及包含抗MIF抗体或者其抗原结合部分的药物组合物。药物组合物也可以包含药学上可接受的载体或者其他治疗试剂。
[0019]本发明也涉及抗MIF抗体或者其抗原结合部分在制备用于治疗免疫性疾病如炎性疾病和过度增生性疾病的药物中的应用。
[0020]本发明进一步地涉及抗MIF抗体或者其抗原结合部分用于治疗免疫性疾病如炎性疾病和过度增生疾病。
[0021]本发明也涉及用抗MIF抗体或者其抗原结合部分的有效剂量治疗各种免疫性疾病和症状的方法，比 如炎性疾病和过度增生疾病。
[0022]本发明还涉及诊断方法。抗MIF抗体或者其抗原结合部分可用于检测生物样品中的 MIF。
[0023]本发明进一步地涉及一种用于识别能够抑制活性MIF并在动物模型中诱导有益效果的抗MIF抗体的方法。【专利附图】

【附图说明】
[0024]图1.显示本发明中人抗MIF抗体的轻链可变区域的氨基酸序列。
[0025]图2.显示本发明中人抗MIF抗体的重链可变区域的氨基酸序列。
[0026]图3.显示本发明中人抗MIF抗体的轻链可变区域的DNA序列和它的翻译。
[0027]图4.显示本发明中人抗MIF抗体的重链可变区域的DNA序列和它的翻译。
[0028]图5.小鼠II1.D.9对抗对照抗体(C3)和抗MIF抗体Bax94的竞争性实验。通过增加抗体Bax94的量，可以观察到清楚的竞争。 [0029]图6.在腹膜炎动物模型中，与对照抗体(C3)相比，抗体Bax94 (点线)和抗体Baxl52 (短划线)显示了增加的存活率和延迟的死亡时间。
[0030]图7.抗体Bax94与活性MIF和无活性MIF的差别结合。抗体Bax94在直接ELISA形式中与活性MIF结合，然而没有与无活性MIF结合。
[0031]图8.概括人抗MIF抗体的体外特性的表格。
[0032]图9.在以细胞为基础的试验中，抗MIF抗体的促凋亡作用。在用抗体处理PC-3细胞之后，显示的细胞的胱天蛋白酶-3 (效应物胱天蛋白酶)活性。试验重复做三次并且数据表示为平均值土标准偏差。
[0033]图10.抗MIF抗体的反入侵作用。检验PC-3前列腺癌细胞通过被matrigel涂敷的Transwell?插片的入侵。每一个视野的入侵细胞数被计数(400倍放大下的显微镜检查)。来自于3-10个视野的数据被表示为平均值土标准偏差，并且显示出显著性差异。
【具体实施方式】
[0034]定义和一般技术
[0035]除非此处另外定义，与本发明相关的科学和专业词汇所具有的含义应当被本领域中的技术人员共同理解。通常，此处描述的与细胞组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学相关的命名及其技术是本领域中为人所熟知的和被共同使用的。本发明的方法和技术通常是根据本领域中为人所熟知的常规方法来操作的，正如贯穿本说明书被引用和被讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所描述的一样，除非另有陈述。参加，如SambiOOk等人的《分子克隆:实验室手册》，第二版，美国冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(1999),和Ausubel等人的《当代分子生物学流程》，Greene出版协会(1992)，以及Harlow和Lane的《抗体:实验室手册》，美国冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1990)，并入此文以供参考。
[0036]“MIF”或者“巨噬细胞游走抑制因子”指的是蛋白质，其是已知的免疫和炎症反应中的关键的中介体，特别是糖皮质激素的反向调节剂。MIF包括哺乳动物MIF，特别是人MIF(Swiss-Prot最初登录号:P14174),其中单体形式被编码成有115个氨基酸的蛋白质,但是由于初始的甲硫氨酸被切除，产生有114个氨基酸的蛋白质。“MIF”也包括“GIF”(糖基化抑制因子)及其它形式的MIF如MIF融合蛋白。MIF中氨基酸的编号起始于N末端甲硫氨酸(氨基酸I)并结束于C末端丙氨酸(氨基酸115)。
[0037]术语“活性(的)MIF”指的是MIF天然存在的构象同工型，与其生物功能相关。活性的MIF包括可以在细胞表面上被观察到的同工型(如THPl等等)。活性MIF也包括存在于被细菌攻击后的哺乳动物血清中的MIF同工型。
[0038]“抗体”指的是完整的抗体或者可与完整的抗体进行特异性结合竞争的抗原结合部分。通常参见《基础免疫学》，第7章(Paul，W.编著，第2版。Raven出版社，纽约(1989))(并入本文以供参考)。术语抗体包括基因工程化形式比如嵌合的或者人源化的抗体。
[0039]术语抗体的“抗原结合部分”指的是抗体的有能力特异性地与抗原(如MIF)结合的一个或多个片段。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或者通过酶法或化学法裂解完整的抗体来生成。抗原结合部分包括Fab、Fab’、F (ab’)2、Fv和互补性决定簇区域(⑶R)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体和含有至少一部分足以使特异性抗原与多肽结合的抗体的多肽。从N末端至C末端，成熟轻链和重链可变区域两者都包含区域FR1XDR1、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。氨基酸至每个结构域的分配符合Kabat限定，参见“免疫兴趣的蛋白质序列”(国立卫生研究院，Bethesda，马里兰州(1987和1991))，Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917 (1987)，或者 Chothia 等人，Nature.342:878-883 (1989)。抗体或者其抗原结合部分可以被衍生化或者被连接至另一个功能性分子(如另一个肽或者蛋白质)。例如，抗体或者其抗原结合部分可以被功能性地连接至一个或多个其他分子实体比如另一个抗体(如双特异性抗体或者双抗体)、可检测的试剂、细胞毒素试剂、药物试剂和/或连接分子。
[0040]术语“人的抗体”指的是任何其中可变结构域和恒定结构域序列是人的序列的抗体。该术语包含具有来源于人基因的序列的抗体，但是该序列被改变过，比如为了减少可能的免疫原性、增加亲和性、删除可能引起不想要的折叠的半胱氨酸等等。该术语包含这种抗体:非人类细胞中重组产生的、或许可以给予人类细胞中一般没有的糖基化。
[0041]术语“人源化抗体”指的是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F (ab’)2、片段、或者抗体中其他抗原结合部分)，它们包含来源于非人类免疫球蛋白的序列。
[0042]术语“嵌合抗体”指的是包含来自于`两个或更多不同种类的区域的抗体。
[0043]术语“被分离的抗体”或者“被分离的其抗原结合部分”指的是抗体或者其抗原结合部分已经被识别并从抗体来源中被选择，所述抗体来源比如使噬菌体展示文库或者B细胞库。
[0044]术语“KD”指的是特定抗体的Fab部分与各自的抗原的平衡解离常数。
[0045]术语MIF的“中心区域”和“C末端区域”指的是人MIF中分别包含氨基酸35_68和86-115的区域。
[0046]术语“抗原表位”包括任何蛋白决定部位，其能够与免疫球蛋白或者抗体片段特异性地结合。抗原表位决定簇通常由化学活性表面集合的分子比如暴露的氨基酸、氨基糖或者其它碳水化合物侧链组成，并且通常有特定的三维结构特征以及特定的荷电特性。
[0047]术语“载体”指的是能够转运另一个与之相连接的核酸的核酸分子。在一些实施方式中，载体是质粒，即附加的DNA片段可与之相连接的环状双股DNA环。
[0048]术语“寄主细胞”指的是在引入表达载体后能够产生重组蛋白质的细胞系。术语“重组细胞系”指的是被导入重组表达载体的细胞系。应当理解，“重组细胞系”指的不仅是特定的个体细胞系而且是此种细胞系的后代。因为由于突变或者环境影响而在后续的世代中可能出现的某些修饰，所以此种后代实际上可以不必与亲细胞相同，但是仍然被包括在此处使用的术语“重组细胞系”的范围中。
[0049]术语“药学上可接受的载体”指的是在生理上是相容的任何和所有的溶剂、分散齐L1、包衣、抗菌试剂和抗真菌试剂、等渗试剂和吸收延迟剂等等。
[0050]抗MIF抗体
[0051]在一个实施方式中，本发明涉及被分离的单克隆抗体或者其抗原结合部分，其可特异性地与人MIF的C末端或中心区域相结合，并且进一步地抑制人MIF的生物功能。在一些实施方式中，单克隆抗体是人单克隆抗体。在其他实施方式中，单克隆抗体是人源化的单克隆抗体。
[0052]在一些实施方式中，抗MIF抗体的轻链包含的氨基酸序列与以下抗体的\氨基酸序列相同:抗体 Bax8(SEQ ID NO:1)、抗体 Bax69 (SEQ ID NO:2)、抗体 Bax74 (SEQ ID NO:3)、抗体 Bax94 (SEQ ID NO:4)、抗体 Baxl52 (SEQ ID NO:5)、抗体 BaxAlO (SEQ ID N0:6),或者包含的氨基酸序列与上述的氨基酸序列有85%、更优选90%的序列同源性。在一些实施方式中，轻链包含上述抗体中任何一个抗体的从CDRl开始至CDR3末端的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗MIF抗体的轻链至少包含图1中所示氨基酸序列中的轻链⑶R1、⑶R2或 CDR3。
[0053]在一些实施方式中，重链包含以下抗体的可变区(Vh)的氨基酸序列:抗体Bax8(SEQ ID NO:7)、抗体 Bax69 (SEQ ID NO:8)、抗体 Bax74 (SEQ ID NO:9)、抗体 Bax94 (SEQID NO:10)、抗体 Baxl52 (SEQ ID NO: 12)、抗体 BaxAlO (SEQ ID NO: 12)，或者包含的氨基酸序列与上述的氨基酸序列有85%、更优选90%的序列同源性。在一些实施方式中，重链包含上述抗体中任何一个抗体的从CDRl开始至CDR3末端的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗MIF抗体重链至少包含图2中所示氨基酸序列中的重链⑶R1、⑶R2或⑶R3。
[0054]抗MIF抗体的类别和亚类
[0055]本发明的抗MIF抗体是被分离的单克隆抗体。抗MIF抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在其他实施方式中，抗MIF抗体是IgG，并且是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚类。在其他实施方式中，抗体是亚类IgGl或者IgG4。在其他实施方式中，抗体是亚类IgG4。在一些实施方式中，IgG4抗体有一个将丝氨酸(丝氨酸228，根据Kabat编号表)变成脯氨酸的单突变。因此，IgG4的Fe区域中的CPSC亚序列变成CPPC，CPPC是IgGl中的亚序列(Angal 等人，Mol Immunol.1993, 30,105-108)。
[0056]被抗MIF抗体识别的MIF抗原表位
[0057]在一些实施方式中，本发明涉及抗MIF抗体或其抗原结合部分，其特异性地分别与跨越人MIF中的氨基酸35-68或86-115的区域相结合，优选抗MIF抗体特异性地分别与跨越氨基酸50至68或者86至102的区域相结合，并且抑制人MIF的生物功能。
[0058]在其他实施方式中，本发明涉及抗MIF抗体，其特异性地与活性MIF相结合，并且进一步地抑制人MIF的生物功能。在一些实施方式中，活性MIF是膜结合性的。
[0059]出人意料地发现，在与人MIF的结合研究中，本发明的抗MIF抗体具有能与抗MIF抗体II1.D.9相竞争的令人惊奇的特性。II1.D.9的竞争能够按在实施例5中所描述的方法测定。
[0060]抗MIF抗体对人MIF的结合亲和力
[0061]本发明涉及抗MIF抗体或其抗原结合部分，其特异性地与人MIF相结合时的Kd是5X IO-7M以下。在其他实施方式中，抗体与人MIF相结合时的Kd是5X IO-8M以下、5Χ10-9Μ以下或者δΧΙΟ,Μ以下。
[0062]抗MIF抗体或其抗原结合部分对人MIF的结合亲和力可以通过本领域中已知的方法进行测定。结合亲和力比如可以通过表面等离振子共振(BIAC0RE)被测定。实施例10举例说明了一种方法，用于通过BIAC0RE技术确定抗MIF抗体的亲和常数。
[0063]在一些实施方式中，本发明进一步地涉及抗MIF抗体或者其抗原结合部分，其特异性地与活性MIF相结合时的Kd小于500ηΜ，并且进一步抑制人MIF的生物功能。在一些实施方式中，抗MIF抗体或者其抗原结合部分与活性MIF相结合时的Kd小于50ηΜ。
[0064]抗MIF抗体的生产
[0065]根据本发明的抗MIF抗体或者其抗原结合部分可以通过本领域的技术人员所熟知的许多方法来制备，比如筛选抗体片段的噬菌体展示文库。可以使用不同形式的噬菌体展示文库，比如scFv或者Fab片段文库等等。噬菌体展示文库被筛选用于对特定的MIF表面抗原具有期望的亲和力的抗体片段，并且从合适的克隆中回收遗传材料。在产生和筛选文库的连续几轮操作中，可以分离出与被分离的最初抗体片段的亲和力相比具有增大的亲和力的抗体片段。被鉴定的抗MIF片段的亲和力可以通过亲和熟化而得到进一步提高。
[0066]制备抗MIF抗体的核酸、载体、寄主细胞和重组体方法
[0067]本发明进一步地涉及编码根据本发明的抗MIF的抗体或者其抗原结合部分的核酸分子，以及包含这种核酸的载体和包含这种载体的寄主细胞，以及重组生产被该核酸分子编码的多肽的方法。
[0068]在一些实施方式中，编码抗MIF抗体的'区域的DNA序列包含的核苷酸序列与图3所示的下组抗体的 ' 序列相同:抗体Bax8(SEQ ID NO:13)、抗体Bax69 (SEQ ID N0:14)、抗体 Bax74 (SEQ ID NO: 15)、抗体 Bax94 (SEQ ID NO: 16)、抗体 Baxl52 (SEQ ID NO:17)、抗体BaxAlO (SEQ ID NO: 18)，或者包含的序列与上述的核苷酸序列中任一个有85%、更优选90%的序列同源性。
[0069]在一些实施方式中，编码抗MIF抗体的Vh区域的DNA序列包含的核苷酸序列与图4所示的以下抗体的Vh序列相同:抗体Bax8(SEQ ID NO:19)、抗体Bax69 (SEQ ID NO:20)、抗体 Bax74 (SEQ ID NO:21 )、抗体 Bax94 (SEQ ID NO:22)、抗体 Baxl52 (SEQ ID NO:23)、抗体BaxAlO (SEQ ID NO: 24)，或者包含的序列与上述的核苷酸序列中的任一个有85%、更优选90%的序列同源性。
[0070]根据本发明的抗MIF抗体的生产包括任何通过基因工程用于重组DNA产生的方法，比如通过RNA反转录和/或DNA扩增以及克隆进入表达载体。
[0071]在一些实施方式中，载体是病毒载体，其中附加的DNA片段可以被连接至病毒基因组中。在一些实施方式中，在寄主细胞中能够自主复制的载体被导入寄主细胞(如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。在其他实施方式中，载体(如非游离型哺乳动物载体)一旦被导入寄主细胞中，就可以被整合入寄主细胞的基因组中，并且因此与寄主基因组一起被复制。此外，某些载体能够引导与它们可操作地连接的基因的表达。这些载体此处被称为“重组表达载体”(或简单地称为“表达载体”)。
[0072]抗MIF抗体可以通过常规的表达载体如细菌载体(如PBR322和其衍生物)或者真核载体来被生产。这些编码抗体的序列可以具有调节序列，该调节序列调节复制、表达和/或寄主细胞的分泌。这些调节序列包含例如启动子(如CMV或SV40)和信号序列。表达载体也可以包含选择性标记和扩增标记，如二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、潮霉素B磷酸转移酶以及胸腺嘧啶核苷激酶。被使用的载体的组成部分，如选择性标记、复制子、增强子，可以购买或者通过常规方法来制备。载体可以被构建用于在不同的细胞培养物中例如在哺乳动物细胞如CHO、COS、HEK293、NSO中、在成纤维细胞、昆虫细胞、酵母或者细菌如大肠杆菌中表达。在有些情况下，被使用的细胞使得被表达的蛋白最佳糖基化。
[0073]抗MIF抗体轻链基因和抗MIF抗体重链基因可以被插入分开的载体中或者两个基因被插入同一个表达载体中。抗体基因通过标准方法被插入表达载体中，比如通过在抗体基因片段和载体上的互补限制性位点连接，或者如果没有限制性位点就通过平端连接。
[0074]抗MIF抗体或其抗原结合部分的的生产可以包括本领域中任何已知的通过转染例如通过电穿孔或者微量注射将重组DNA导入真核细胞的方法。例如,抗MIF抗体的重组表达可以通过下述方法来完成:通过合适的转染，将包含受一个或多个调节序列如强启动子控制的编码抗MIF抗体的DNA序列的表达质粒导入合适的寄主细胞系，导致细胞具有被稳定合并入基因组的序列。根据本发明，脂转染法是可以使用的转染方法的一个例子。
[0075]抗MIF抗体的生产也可以包括本领域中任何已知的例如以连续方式或分批方式培养上述转化细胞的方法，并且抗MIF抗体的表达方法例如是组成型的或者诱导型的。
[0076]根据本发明的寄主细胞可以是任何真核细胞。在一个实施方式中，细胞是能够进行抗MIF抗体翻译后修饰的哺乳动物细胞。例如上述的哺乳动物细胞来源于哺乳动物细胞系，比如选自由SkH印、CHO、HEK293以及BHK细胞所组成的组中的细胞系。在一个实施方式中，抗MIF抗体在DHFR缺乏型CHO细胞系如DXBlI中表达，并且添加G418作为选择性标记。当编码抗体基因的重组表达载体被导入哺乳动物寄主细胞中时，抗体的生产是通过培养寄主细胞足以允许抗体在寄主细胞中表达或者允许抗体被分泌进入寄主细胞生长的培养基中的一段时间而进行。
[0077]抗体MIF抗体可以通 过使用标准蛋白质纯化方法从培养基中被回收。
[0078]另外，抗MIF抗体的生产也可以包括本领域中任何已知的用于抗体纯化的方法，如通过阴离子交换层析或者亲合层析。在一个实施方式中，抗MIF抗体可以通过大小排阻层折而从被细胞培养上清液中提纯。
[0079]抗MIF抗体的特点
[0080]本发明涉及抗mIF抗体或其抗原结合部分，其具有以下特点中的至少一个特点:
[0081]a)与人MIF的C末端或中心区域相结合；
[0082]b)抑制拮抗糖皮质激素(glucocorticoid overriding, GC0)活性；
[0083]c)抑制细胞系如成纤维细胞或者癌细胞(如NIH/3T3或PC-3)的增殖；
[0084]d)与活性MIF相结合；
[0085]e)不与无活性MIF相结合；
[0086]f)与鼠抗MIF抗体II1.D.9竞争。
[0087]在一些实施方式中，活性的MIF是通过利用温和氧化剂比如胱氨酸处理人MIF、或者通过将人MIF固定在支持物比如ELISA板或者小珠上而产生的活性MIF的同工型。在其他实施方式中，活性MIF是利用细菌攻击动物后在体内产生的活性MIF的同工型。在其他实施方式中，活性MIF是在细胞(如THPUCFB)的表面体内产生的活性MIF的同工型。[0088]在一些实施方式中，无活性MIF是被还原的MIF (如在实施例7中所描述的)或者在细胞内被储存的MIF。
[0089]在其他实施方式中，抗MIF抗体或者其抗原结合部分与活性MIF相结合时的Kd小于 500nM。
[0090]抗MIF抗体的药物组合物及治疗方法
[0091]本发明也涉及包含抗MIF抗体或者其抗原结合部分的组合物,用于需要治疗MIF相关疾病的个体的治疗，特别是免疫性疾病如炎性疾病和过度增生疾病。
[0092]在一些实施方式中，需要治疗的受试者是人。过度增生疾病，如癌症，可以通过本发明的抗MIF抗体被治疗。癌症可以包括任何组织或器官的癌症，并且包括、但不限于脑、肺、鳞状上皮细胞、膀胱、胃的、胰的、心脏、头部、颈部、肝脏、肾脏、卵巢、前列腺、结肠直肠的、食道的、妇科的、鼻咽部的癌症、或者甲状腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病或者多发性骨髓瘤。尤其是，本发明的抗MIF抗体在治疗乳腺、前列腺、结肠和肺的恶性肿瘤上是有用的。
[0093]本发明也包括用于治疗个体包括人中的下述炎性疾病的方法:例如脉管炎、关节炎、脓毒、败血性休克、内毒素休克、中毒性休克综合征、获得性呼吸窘迫综合征、肾小球肾炎、炎性肠病、局部性回肠炎、溃疡性结肠炎、腹膜炎、肾炎、遗传过敏性皮炎、哮喘、结膜炎、发热、疟疾或者牛皮癣，该方法包括将抗MIF抗体或其抗原结合部分的治疗有效剂量给药于需要其的上述个体的步骤。
[0094]在其他实施方式 中，包含上述抗MIF抗体的组合物被用于治疗选自由肾小球肾炎、炎性肠病、肾炎和腹膜炎所组成的组中的炎性疾病。
[0095]治疗可以包括将本发明一种或多种抗MIF抗体或者其抗原结合片段单独地或与药学上可接受的载体一起给药。药学上可接受的载体的一些例子是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等、以及其组合物。在很多情形里，优选组合物中包括等渗试剂，例如糖类，多元醇如甘露糖醇、山梨醇，或者氯化钠。药学上可接受的物质的另外的例子是湿润剂或者较小量的辅助物质比如润湿剂或者乳化剂、防腐剂或者缓冲剂，其提高了保存期限或者抗体的有效性。
[0096]本发明的抗MIF抗体和包含它们的药物组合物，可以与一种或多种其它治疗试剂、诊断试剂或预防试剂一组合起被给药。取决于被治疗的疾病，附加的治疗试剂包括其他抗肿瘤转化、抗肿瘤、抗生成血管、化疗剂或者留族化合物。
[0097]本发明的药物组合物可以有多种形式，例如液体、半固体和固体剂型。例如液体溶液(如可注射的和浸制的溶液)、胶体溶液或者悬浮液、片剂、药丸、粉末、脂质体和栓剂。优选的形式取决于想要的给药模式和治疗用途。一般的优选组合物是可注射的或者浸制溶液的形式，如类似于被用于人被动免疫接种的组合物。给药的优选方式是肠胃外的(如静脉的、皮下的、腹膜的、肌肉的)方式。在优选的实施方式中，抗体通过静脉注入或者注射被给药。在另一个优选的实施方式中，抗体通过肌肉注射或者皮下注射被给药。正如本领域的技术人员所理解的那样，给药路径和/或方式将取决于想要的结果而变化。
[0098]抗MIF抗体可以一次给药，然而更优选的是多次给药。例如，抗体给药可以是从每天三次至每六个月或更长给药一次。给药可以按进度表进行，如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每星期一次、每两星期一次、每月一次、每两月一次、每三月一次和每六月一次。[0099]本发明也涉及包含抗MIF抗体或者其抗原结合片段在制备用于治疗免疫性疾病如炎性疾病和过度增生疾病的药物中的应用。
[0100]本发明进一步地包括抗MIF抗体或者其抗原结合片段用于治疗免疫性疾病如炎性疾病和过度增生疾病。
[0101]本发明也包括抗MIF抗体或者其抗原结合片段用于诊断的方法。在一个实施方式中，抗MIF抗体或者其抗原结合部分可用于检测生物样品中的人MIF。
[0102]抗MIF抗体或其抗原结合部分也可以被用于测定组织或来源于组织的细胞中的细胞表面MIF的水平。在一些实施方式中，组织是有病的组织。组织然后可以被用于免疫测定以便确定如总MIF水平、MIF的细胞表面水平或者MIF的定位。
[0103]本发明进一步地涉及包含本发明的抗MIF载体或者抗原结合部分、或者包含这种抗体或其部分的药物组合物的试剂盒。试剂盒可以包括除抗体或者药物组合物之外的诊断试剂或者治疗试剂。试剂盒也可以包括用于诊断方法或者治疗方法的说明书。
[0104]本发明进一步地涉及一种用于识别能够抑制人MIF生物功能并且诱导动物模型中有益效果的抗MIF抗体的方法，其通过下述步骤进行:
[0105]a)选择与活性MIF结合而不与无活性MIF结合的抗体
[0106]b)在体外测试如拮抗糖皮质激素(GCO)测试或者细胞增殖测试中检测上述抗体，
[0107]c)选出抑制GCO和/或细胞增殖的抗体。
[0108]结果表明，只与活性MIF结合而不与无活性MIF结合的、并进一步抑制GCO和/或细胞增殖的抗MIF抗体在动物模型中诱导了有益效果(例如，见实施例6)。
[0109]本发明将通过下面的实施例进一步地举例说明，但也不限于此。
[0110]实施例
[0111]实施例1:抗体选择
[0112]噬菌体展示技术被用来产生人抗MIF抗体片段。
[0113]从噬菌体展示文库开始，进行了不同的筛选系列，它们中的三个使用了全长MIF(被包被的人MIF/溶液中的人MIF/人-鼠交替的MIF)。其它筛选系列使用六个MIF衍生的肽与全长MIF交替。通过将MIF蛋白划分为大约30个氨基酸的六个肽，重叠长度大约是15个氨基酸，设计出这六个肽。在几轮选择后，鉴别出独特的结合物，所有独特的结合物被表达并被纯化为人IgG4抗体。在一些试验中检测这些抗体，以便证明MIF的体外抑制。进行表位定位以便确定MIF蛋白内的结合区域。对193个抗体进行了试验，并且根据它们体外抑制MIF的活性被分类。体外试验如下所述。三种小鼠抗MIF抗体被用作对照(II1.D.9，XIV.14.3 和 XIV.15.5)。
[0114]实施例2 =MIF的拮抗糖皮质激素活性(GCO)的抑制
[0115]该方法是建立在内源性MIF抑制的基础之上，即，MIF是通过使用的细胞系而生产的。该方法被用于抗体筛选并用于剂量反应曲线的确定。
[0116]用于抗体筛选的GCO试验THPl悬浮培养物被离心分离，并且细胞被再悬浮在新鲜的全培养基中至细胞密度是每毫升IO6个细胞。培养物被转移至96孔微量培养板(90 μ I/孔)上，并且添加抗MIF抗体至最终浓度是75 μ g/ml。每个抗体重复测试三次。在37°C下过夜温育后，添加地塞米松至最终浓度是2nM，并且在37°C下温育I小时后，添加LPS(3ng/ml最终浓度)。在37°C下进一步温育六个小时后，收获上清液，并且在ELISA (Cytoset试剂盒，可在市场上买到)中测定IL-6浓度。三次测定的结果被平均，并且与对照抗体比较确定IL-6的分泌百分比。导致IL-6分泌小于75%的抗体被评估为阳性。
[0117]用于确定IC50值的试验
[0118]按照筛选试验所描述的方法进行实验步骤，除了使用增加量的抗体之外(一般地为I至125nM)。生成物的剂量反应曲线被表示为与阴性对照抗体相比的％抑制。曲线被用于计算抗体最大抑制效果(％抑制最大值)和显示50%最大抑制效果的抗体浓度(IC50)。
[0119]结果在图8中被概括，第3列(IC50)和第4列(最大抑制)。对于对比，小鼠抗体XIV.14.3只显示了 36%的GCO抑制(数据没有被显示)。
[0120]实施例3:细胞增殖的抑制
[0121]血清刺激静止期的NIH/3T3中MIF的分泌，并且MIF反过来刺激细胞增殖。抗体抑制内源性MIF，因此减少了静止期的NIH/3T3细胞的增殖。增殖的减少是通过掺入3H-胸腺密啶核苷而被测定的。
[0122]每孔1000个NIH/3T3细胞在96孔板上于37°C下在含有10%血清的培养基中温育一周。然后使细胞于37°C下在含有0.5%的血清的培养基中温育饥饿过夜。除去0.5%培养基，并且用含有10%血清、75 μ g/ml抗体和5 μ Ci/ml的3H-胸腺密啶核苷的新鲜培养基来代替。在37°C下在CO2培养箱中温育16小时后，细胞用每孔150 μ I的冷PBS洗涤两次。使用多管移液器，每孔添加150 μ I的5% (w/v)TCA溶液，并且在4°C下温育30分钟。平板用150 μ I PBS洗涤。每孔添加75 μ I含有0.5%SDS的0.5MNa0H溶液，混合并在室温下储存。通过混合5ml的Ultima Gold (Packard)和75 μ I的样品溶液，样品在β -计数器中被测定。每个测定重复三次，并且数值通过t-检验法与对照抗体的数值相比较。显著减少增殖(P〈0.05)的抗体被评估为阳性。结果被概括在图8第5列中。
[0123]实施例4:结合性研究:抗MIF抗体`的抗原表位测定
[0124]将每个肽稀释在偶联缓冲液中至最终肽浓度一般是5 μ g/ml，将其添加至微量培养板(NUNC Immobilizer? Amino Plate F96Clear)上并在 4°C下温育过夜(100 μ I/孔)。作为对照的重组全长MIF和PBS被使用。平板用200 μ I PBST洗涤3次，抗体(在PBS中4 μ g/ml)被添加(100 μ I/孔)并在室温下温育2小时，轻轻振荡。平板用200 μ I PBST洗涤3次并且添加检测抗体(例如被标记的Fe特异性的抗人IgG /HRP, SigmaX 100 μ I/孔)。在室温下轻轻振荡温育I小时后，平板用200 μ I PBST洗涤3次。每个孔都用100 μ I TMB溶液(T-0440，Sigma)在黑暗中温育30分钟。染色反应通过每孔添加100 μ I的1.8Μ H2SO4而被终止。样品在450nm处被测定。
[0125]实施例5:人抗MIF抗体和小鼠抗MIF抗体II1.D.9的竞争
[0126]抗体Bax94被用于与小鼠抗MIF抗体II1.D.9的竞争。
[0127]96孔板(NUNC Maxisorp)用重组人MIF涂敷。小鼠抗MIF抗体I1.D.9和人抗MIF抗体被在TBST/2%BSA中稀释，并且被混合，然而II1.D.9最终浓度维持在2 μ g/ml，而人抗MIF抗体浓度从O μ g/ml增加至一般的32 μ g/ml。在洗涤微量培养板后，施加抗体，并在室温下一般温育2小时。洗涤后，平板与抗小鼠IgG(Fc特异性)过氧化物酶偶联物一起温育，并在室温下温育I小时。洗涤后，平板与TMB溶液一起温育，并且染色反应通过添加H2SO4溶液而被终止。拟合生成的竞争曲线，并计算II1.D.9结合的最大抑制。结果被概括在图8第6列中。[0128]实施例6:在活的大肠杆菌腹膜炎动物模型中抗MIF抗体的增加的存活率
[0129]实验是根据Calandra等人(Nature Immunology, 2000)的方法进行的,使用雌性NMRI小鼠(25-30g，6-10周龄)，并用在15%粘蛋白和4%血红蛋白中的6000CFU的大肠杆菌0111:B4悬浮液腹膜注射。来自于营养琼脂培养基平皿培养的两个或三个菌落(大肠杆菌0111:B04)被接种于IOml的TSB中，并且在36°C下振荡温育过夜。培养物被生理盐水稀释至所需的浓度，过夜培养物一般达到2X 109CFU/ml，并且与粘蛋白和血红蛋白混合(I体积的稀释的接种物，2体积的15%的粘蛋白，2体积的4%血红蛋白)。因为接种物混合物倾向于沉淀出来，所以在注射间被混合。大的(如23规格)的针头被用于注射，以免针头被注射混合物中的微粒所堵塞。抗体Bax94 (IgG4)和与同种型匹配的对照抗体在细菌攻击前2小时被腹膜间给药。抗体剂量一般是SOOyg/小鼠，并且每组使用20只小鼠。人的抗MIF抗体的IgGl和IgG4同种型显示出在存活率/至死亡的时间上在统计学上有显著影响。图6显示由抗体Bax94和抗体Baxl52 (IgG4)得到的结果。Kaplan-Meier统计法被用于存活曲线的评估。
[0130]实施例7:对活性MIF的结合特异性
[0131]本发明描述的抗MIF抗体能够分别区分活性MIF和无活性MIF，两者分别是通过轻度氧化或还原产生的。这些构象体之间的区别通过ELISA或者表面等离振子共振来测定。
[0132]用于测定抗体差别结合的ELISA:
[0133]?通过轻度氧化MIF转化成它的活性构象。重组人1正(？85中0.511^/1111)在371:下与3倍过量(体积)的PBS中L-胱氨酸饱和溶液(大约0.4-0.5mM的L-胱氨酸)一起温
育3小时。然后在Slide-A-Lyzer?透析盒中MIF用PBS透析两次，分子量截断值是7kDa
(Pierce)。
[0134].MIF转化成它的无活性构象。
[0135]在4°C下MIF以0.5mg/ml的浓度与8_16mM的二硫苏糖醇(最终浓度)一起温育过夜而被还原。
[0136].ELISA 流程。
[0137]抗MIF抗体被涂敷在96孔的微量培养板(NUNC Maxisorp?)上，浓度是5 μ g/ml(用涂敷缓冲剂稀释)。在用TBST (含有0.l%Tween-20 (v/v)的Tris缓冲盐水)洗涤平板，并且用TBST/2%BSA(TBST和2%牛血清白蛋白(w/v))封闭后，添加活性的或者无活性的MIF的稀释系列，并在室温下温育1-2小时。被结合的MIF通过使用多克隆兔抗MIF抗体和辣根过氧化酶标记的山羊抗兔抗体(Biorad)来检测。TBST/2%BSA被用来稀释MIF、兔抗MIF抗体和过氧化物酶偶联物，以便减少非特异性的结合。图7显示了利用抗体Bax94得到的ELISA结果。
[0138] 通过Biacore评估抗体的差别结合
[0139]活性和无活性的MIF与抗体Bax94的结合动力学通过使用BiaCore3000系统的表面等离振子共振分析而被检测。因此，10000应答单位的Bax94被用CM5 (为羧甲基葡聚糖)基质固定在传感器芯片上，并且与活性或无活性的MIF huMIF 一起在促还原和促氧化的谷胱甘肽氧化还原缓冲剂中温育，缓冲剂范围是在HBS-EP缓冲液中(GE Healthcare)从
4.8mM GSH/0.2mM GSSG (GSSG=氧化型谷胱甘肽)至5mM GSSG0作为对照，在第二个含有固定的同种型对照抗体的流动池中，MIF被用于结合分析。对照抗体和抗体Bax94的结合应答单位被减去用于评估。
[0140]实施例8 =THP-1细胞表面上活性MIF的检测
[0141]细胞与抗MIF抗体Bax94—起温育。细胞用冰冷的PBS洗涤，并且再悬浮在冷的细
胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology8 )中。磁性蛋白 G Dynabeads? (Invitrogen)
用TBST+5%脱脂奶粉(w/v)封闭、洗涤并且被添加至被裂解的细胞中。在4°C下过夜，进行免疫沉淀反应。然后用细胞裂解缓冲液和TBST洗涤小珠，并且在SDS PAGE样品缓冲液(没有还原剂)中煮沸。样品经过非还原性SDS PAGE，用于蛋白质印迹分析。
[0142]实施例9:抗MIF抗体与膜结合性MIF的结合
[0143]THP-1细胞用冰冷的PBS洗涤，并且再悬浮在添加了 200 μ g/ml小鼠IgG的冷的细胞染色缓冲液(Biolegend)中。FITC或者TRITC标记的抗MIF抗体被添加至最终浓度一般是200-500nM，并且在4°C下温育。细胞随后用冰冷的细胞染色缓冲液洗涤，并再悬浮在添加了 Via-Prohe?细胞存活力溶液(BD Biosciences)的细胞染色缓冲液中。细胞在FACSCanto? II流式细胞计系统(BD Biosciences)中被测定，并且将活细胞群体的中间FITC-/TRITC-位移与染色标记的同种型对照抗体相比较。
[0144]实施例10:通过Biacore抗MIF抗体的Fab片段的亲合力测定
[0145]一般地，40RU单位的人重组体MIF用CM5 (为羧甲基葡聚糖)基质(Biacore)固定在传感器芯片上。Fab片段用HBS-EP稀释，一般以6_10nM的浓度范围被注射。在每个周期后，芯片用50mM Na0H+lM NaCI再生。根据1:1朗缪尔模型计算亲合力。结果被概括在图8第7列中。
[0146]实施例11:抗MIF抗体在新月体肾小球肾炎动物模型中的有益效果
[0147]在Frederick W.K.Tarn 等人(Nephrol Dial Transplant, 1999,1658-1666)描述的新月体肾小球肾炎大鼠模型中检测抗MIF抗体。
[0148]通过单一静脉注射抗大鼠肾小球基底膜血清，在Wistar Kyoto大鼠中诱导肾毒性肾炎。在试验的预防性建立中，用抗MIF抗体和同种型匹配对照抗体的治疗是在诱导肾炎时(第O天)通过腹腔注射抗体开始的。治疗一般是隔天重复，并且动物在第7天被拣出用于组织分析。尿液在实验前(底线)被收集，并且收集直至实验结束前(第7天)。在治疗建立中，用抗MIF抗体的治疗开始于诱导疾病后的第4天，并且每隔一天被重复。大鼠一般在第8天被拣出。尿液在实验前(底线)、治疗开始前(第4天)和动物拣出前(第8天)被收集。抗体剂量一般是每次注射l_20mg/kg，并且每个组使用6至8只大鼠。通过测定蛋白尿、巨噬细胞渗透进肾小球和组织损害(新月体形成)来确定病重程度。在预防性实验中，用抗MIF抗体Bax69 (每个剂量10mg/kg)治疗7天，与用对照抗体治疗的动物相比，导致47%的蛋白尿减少。与对照抗体治疗的动物相比较，被建立的疾病的治疗(治疗实验)导致了蛋白尿的剂量依赖性减少16% (每个剂量10mg/kg的Bax69)和34% (每个剂量20mg/kg的Bax69)。
[0149]实施例12:抗MIF抗体在溃疡性结肠炎(Rag-/-小鼠中天然T细胞的过继转移)动物模型中的有益效果
[0150]C57BL/6小鼠被杀死，并且通过脾脏细胞群体的荧光激活细胞分类术来分类CD45RBhi细胞(天然T细胞)。CD45Rbhi细胞(5x105)通过腹膜内注射给Rag-/_C57BL/6小鼠(7-9周龄),小鼠在大约2周后发展成溃瘍性结肠炎(de Jong等人，Nature immunology.,2001，1061-1066 )。抗MIF抗体和同种型对照抗体腹膜内注射一周两次(Img/小鼠/剂量)。在预防性建立中，治疗开始于注射T细胞时。在治疗建立中，治疗开始于诱导疾病后的4周。小鼠每周监控重量和病情发展。一般在⑶4⑶45RBN细胞转移进Rag-/-C57BL76接收者之后的八个星期，计算疾病活动性指数(DAI)，并且收集结肠切片用于组织指数(HI)评分。疾病活动性指数(DAI)和组织指数(HI)在动物模型结束时被确定(DAI是基于四个参数:隆起和消瘦(分数O或者I)，结肠加厚(0-3)和粪便黏稠度(0-3))。在治疗实验中，抗MIF抗体Bax69和BaxAlO被用于治疗已建立的疾病，并且与同种型对照治疗的小鼠相比较，平均值DAI显著地下降了大约60% (Bax69)和大约40% (BaxAlO)0此外，平均值HI分数在用Bax69治疗后减少了大约33%。[0151]实施例13:抗MIF抗体在溃疡性结肠炎动物模型拮抗性抗CD40模型)中的有益效果
[0152]该模型是基于巨噬细胞和树状细胞被拮抗性抗CD-40抗体活化，该抗CD-40抗体可在RagW小鼠中诱导类似于IBD的肠道病变。
[0153]年龄/性别匹配的Rag-1-/-小鼠(4_5周龄)购自杰克逊试验室，并且在实验前在动物厂房中饲养两周。拮抗剂CD40单克隆抗体(FGK45，lgG2a)或者同种型对照大鼠lgG2以lmg/ml的浓度溶解在PBS中。5组(每组10只小鼠)经腹膜注射200 μ g的拮抗剂抗⑶40单克隆抗体，并且其中有4组在第O天和第I天(2xlmg/小鼠)用抗MIF抗体治疗。第6组(10只小鼠)仅用同种型对照(大鼠lgG2a，健康对照)注射。小鼠在下一个7天称重。在第7天，计算疾病活动性指数(DAI)，并收集结肠切片用于组织指数(HI)评分。DAI值是建立在以下基础之上:隆起(0-1)、消瘦(0-1)、粪便黏稠度(0-3)和结肠加厚(0-3)。组织评分建立在以下基础之上:厚度(0-3)、隐窝伸长、炎症(0-3)和脓肿(0-1)。与同种型对照治疗的小鼠相比较，用抗MIF抗体Bax94、BaxA10和Bax69治疗显著地减少了 DAI分数(BaxAlO:减少约48% ；Bax94减少约62% ；Bax69减少约73%)。此外，这些抗体也减少了 HI平均分数。
[0154]实施例14:通过抗MIF抗体抑制Mfl裸鼠中肿瘤的生长
[0155]人前列腺腺癌细胞(PC-3)从指数增长期的培养物中获得，并与去掉生长因子的matrigel混合。在0.25ml matrigel中的2X IO6个细胞通过皮下注射接种于Mfl裸鼠的右肋。使用抗MIF抗体Bax94和同种型对照C3的治疗开始于接种后一天(0.6mg抗体/小鼠/天)，并且每隔一天重复一次。肿瘤大小的测定一般开始于细胞注射后两周，并且每隔一天做一次。使用公式V=0.5XaXb2计算体积(此处“a”是最大直径并且“b”是最小直径)。用Bax94治疗的小鼠中肿瘤的生长显著地被减小，而同种型对照治疗组中在肿瘤诱导后28天分析的肿瘤平均体积比Bax94治疗组高4.3倍。
[0156]在实验的治疗建立中，抗体治疗开始于肿瘤移入后一周。每剂量50mg/kg的同种型对照抗体C3和抗MIF抗体Bax69每隔一天通过腹膜注射。在治疗后22天，C3治疗组中被测定的肿瘤体积的中位值比Bax69治疗组高2.7倍。
[0157]实施例15:抗MIF抗体的促凋亡作用
[0158]抗MIF抗体的促凋亡作用显示在使用人前列腺癌细胞系PC-3的以细胞为基础的胱天蛋白酶-3测试中。PC-3细胞被接种在有10%FCS的IOcm的培养皿(约IO6个细胞/皿)上。在24小时后添加含有IOOnM抗体Bax94或IOOnM对照抗体C3的新鲜培养基。在另一个48小时的温育期后，制备细胞裂解液，并且通过添加荧光标记的胱天蛋白酶底物来测定胱天蛋白酶-3活性(图9)。[0159]实施例16:肿瘤细胞入侵的抑制
[0160]通过使用人前列腺癌细胞系PC-3，在Transwell?入侵试验中检测抗MIF抗体Bax94和Bax69。每孔5X IO4个PC-3细胞被接种在24孔的Transwell?皿(孔径大小8 μ m)中，Transwell?皿在聚碳酸酯膜的底面上涂敷聚D-赖氨酸,并且在Transwell?插入表面上涂敷去掉生长因子的matrigel。在10%FCS存在的情况下，使细胞附着4小时。然后，培养基变成无血清的培养基，并且经细胞饥饿过夜(即16小时)。随后，添加化合物(IOnM MIF,500nM抗体)至下室。使得细胞迁移穿过多孔滤膜24小时。在温育期后，膜下的表面上附着的迁移细胞通过吉姆萨溶液染色。粘附于膜下表面的细胞数在400倍放大倍数的独立视野中被计 数(图10)。
【权利要求】
1.一种单克隆抗体或者其抗原结合部分，其特征在于，其可特异性地结合MIF的中心区域，所述抗体是抗体Bax69。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或者其抗原结合部分，其可特异性地结合MIF的中心区域，即人MIF中跨越氨基酸50-68的区域，并且抑制人MIF的生物功能。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体或者抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或者抗原结合部分具有下述特点中的至少一个特点: a)抑制拮抗糖皮质激素(GCO)活性； b)抑制癌细胞或者成纤维细胞的增殖； c)与活性MIF结合； d)不与无活性MIF结合； e)与鼠抗MIF抗体II1.D.9竞争。
4.如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或者抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或者抗原结合部分以小于500nM的Kd结合人MIF。
5.如权利要求1所述的单克隆抗体或者抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或者所述抗原结合部分结合活性MIF。
6.如权利要求1所述的单克隆抗体或者其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体是IgG4亚类抗体。
7.如权利要求6所述的单克隆抗体或者其抗原结合部分，其特征在于，所述IgG4亚类有单一突变，凭此IgG4的Fe区域中的CPSC亚序列变成CPPC。
8.一种单克隆抗体或者抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或者抗原结合部分包含: a)独立地选自一种抗体的重链中的重链⑶Rl、⑶R2和⑶R3，所述抗体是抗体Bax69； b)独立地选自一种抗体的轻链中的轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3，所述抗体是抗体Bax69。
9.一种单克隆抗体或者其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体包含: c)重链的氨基酸序列，其至少有90%与抗体Bax69的重链氨基酸序列相同； d)轻链的氨基酸序列，其至少有90%与抗体Bax69的轻链氨基酸序列相同。
10.如权利要求1至9中任一项所述的单克隆抗体或者抗原结合部分，其特征在于，用于治疗免疫性疾病，其中所述免疫性疾病是炎性疾病或者过度增生疾病。
11.如权利要求10所述的单克隆抗体或者抗原结合部分，其特征在于，所述炎性疾病选自下组:脉管炎、关节炎、脓毒、败血性休克、内毒素休克、中毒性休克综合征、获得性呼吸窘迫综合征、肾小球肾炎、炎性肠病、局部性回肠炎、溃疡性结肠炎、腹膜炎、肾炎和牛皮癣。
12.—种药物组合物，其包含如权利要求1至9中任一项所述的单克隆抗体或者抗原结合部分和药学上可接受的载体。
13.如权利要求12所述的药物组合物,其特征在于,所述单克隆抗体是抗体Bax69。
14.一种如权利要求1至9中任一项所述单克隆抗体或抗原结合部分、或者如权利要求12或13所述药物组合物在制备治疗个体包括人在内的免疫性疾病的药物中的应用，所述免疫性疾病选自炎性疾病或者过度增生疾病，其中将治疗有效剂量的如权利要求1至9中任一项所述单克隆抗体或抗原结合部分、或者如权利要求12或13所述药物组合物给药于需要其的所述个体，其中所述抗体或者所述抗原结合部分进一步抑制人MIF的生物功能。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述炎性疾病选自下组:脉管炎、关节炎、脓毒、败血性休克、内毒素休克、中毒性休克综合征、获得性呼吸窘迫综合征、肾小球肾炎、炎性肠病、局部性回肠炎、溃疡性结肠炎、腹膜炎、肾炎和牛皮癣。
16.一种被分离的细胞系，其可产生如权利要求1至9中任一项所述的单克隆抗体或者抗原结合部分。
17.—种被分离的核酸分子,其包含一种核苷酸序列,所述核苷酸序列编码如权利要求1至9中任一项所述的单克隆抗体或者抗原结合部分的重链或者轻链。
18.—种载体，其包含如权利要求17所述的核酸分子，其中所述载体可选择地包含可操作地连接于所述核酸分子的表达控制序列。
19.一种寄主细胞，其包含如权利要求18所述的载体、或者如权利要求17所述的核酸分子。
20.如权利要求19所述的寄主细胞，其特征在于，其包含编码如权利要求1至9中任一项所述单克隆抗体或者抗原结合部分的重链的核酸分子和编码所述单克隆抗体或者抗原结合部分的轻链的 核酸分子。
21.—种生产单克隆抗体或者其抗原结合部分的方法，包括:在适宜条件下培养如权利要求19所述的寄主细胞或者如权利要求16所述的细胞系，并且回收所述抗体或者其抗原结合部分。
22.一种用于鉴别能够抑制人MIF生物功能、并且诱导在动物模型中的有益效果的抗MIF抗体的方法，其通过下述步骤进行: a)选择与活性MIF结合而不与无活性MIF结合的抗体； b)在体外测试中检测所述抗体； c)选出抑制GCO和/或细胞增殖的抗体。
【文档编号】C12N15/13GK103724430SQ201410037650
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2008年12月30日 优先权日:2008年1月4日
【发明者】兰道夫·凯尔施鲍默, 弗里德里希·谢夫林格, 曼弗雷德·里格尔, 米夏埃尔·蒂勒, C.海尔特·穆德, 于尔根·穆埃尔博格, 勒内·霍尔 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特保健股份有限公司, 戴克斯公司